一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种同时实现两种靶标分析物高灵敏度检测的双荧光探针的制备方法。

背景技术：

生物传感技术作为分析化学学科中的新型分析技术，具有灵敏度高、专一性好、准确度高、成本低廉、分析速度快以及易于自动化监测等优点，广泛的应用于生命科学，生物医学，食品等领域。

纳米硅材料(silicamaterialsformedicalapplication,openbiomedengj.2008;2:1–9.)具有高的比表面积和大的孔容，且表面易化学修饰，因此在生物医学领域的应用价值越来越受到人们的重视。

核酸适配体是由20~60个碱基所组成的、能够特异性识别目标分析物的rna或单链dna片段(aptamer-basedfluorescentbiosensors,currmedchem.2011;18:4175-4184.)，可在体外通过指数级富集配体系统进化技术筛选出来，具有可与特异的目标分析物（如：凝血酶，溶菌酶，atp等）高效、专一结合等特点，并易于修饰和功能化。近年来被广泛应用于传感探针的制备，实现生物样品高灵敏度、高选择性传感与识别领域（dna-templatedaptamerprobeforidentificationoftargetproteins.analchem.2017;89(7):4071-4076.）。提高探针对复杂样品中多种目标分析物的高灵敏度识别与检测，可以显著降低检测成本，提高检测效率，对于环境污染监测、临床医学等领域具有重要的意义。

技术实现要素：

针对复杂样品中多种目标分析物同时检测所存在的困难，本发明旨在提供一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针，可同时检测两种靶标分析物，该探针的特异选择性好、检测灵敏度高、检出限低。本发明还提供了该双荧光探针的制备方法和应用。

本发明提供了一种基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸适配体链的5’端分别修饰不同的荧光基团cdteqds（λem=545nm）及染料cy5（λem=660nm），然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种dna单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。

上述制备方法，具体包括以下步骤：

①硅纳米微球的制备：将20~50μl的四乙氧基硅烷溶于10~20ml的乙醇中，在2000~3000rpm转速的搅拌下，依次加入水10~20ml、乙醇5~10ml、氢氧化胺0.2~0.4ml的混合溶液，混合物室温搅拌2小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有10~30μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10ml，混合物室温继续反应4小时，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤后40℃烘干24h；

②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补dna单链修饰在硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和nacl的混合液中，得到浓度为30-50mg/ml的硅纳米微球溶液；

先加入3’端修饰有羧基的凝血酶的核酸适配体互补的dna单链（50~150nm，10~50μl），混合溶液中加入n-羟基丁二酰亚胺（nhs）溶液（0.5~1.0mg/ml，20~100μl），反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补dna单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，可计算出与凝血酶的核酸适配体互补的dna链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补dna单链（50~150nm，10~50μl），混合溶液中加入nhs溶液（0.5~1.0mg/ml，20~100μl），反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，可计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的dna链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补dna单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；其中，硼酸缓冲液的ph=8.5；离心速度为8000~10000rpm；

③基于核酸适配体的双荧光探针的制备：固定有两种核酸适配体互补dna单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，得到的溶液中硅纳米微球浓度为100~200mg/ml，先加入5’端修饰cy5的凝血酶适配体（20~100nm），在室温下振荡反应0.5~2小时后，再加入5’端修饰cdteqds的溶菌酶适配体（20~100nm），在室温下振荡反应0.5~2小时，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅纳米微球球与核酸适配体的双荧光探针；

上述制备方法，所述步骤①硅纳米微球的制备中，四乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、无水乙醇及水的体积比为1~2.5：0.5~1.5：500~1000：1000~2000，氢氧化胺和水的体积比为1~2：50~100，混合物先在室温下反应10-15h，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后，再在室温下反应1-2h，所得硅纳米微球的粒径为40nm-150nm。

上述制备方法，所述步骤②中，将凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补dna单链修饰在硅纳米微球表面，硼酸缓冲液和nacl的体积比为0.5~1：1，加入的凝血酶适配体互补dna单链（50~100nm）与溶菌酶适配体互补dna单链（50~100nm）的体积比为1：1，混合后室温放置时间为10-15h。

上述制备方法，所述步骤③中，凝血酶与溶菌酶的核酸适配体分别与硅纳米微球上的互补dna单链互补配对时，将硅纳米微球溶解在杂化缓冲液中，所述杂化缓冲液由nacl和柠檬酸钠组成，该杂化缓冲液中nacl（750mm）、柠檬酸钠（75mm）体积比为1~20：10~50，杂化缓冲液的ph为8.0-8.5，修饰有荧光基团的凝血酶及溶菌酶的核酸适配体的体积比为1：1，在室温下震荡反应1h-4h。

本发明提供了一种上述制备方法制备出的基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针。

本发明提供了上述基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针在同时测定实际样品中两种靶标分析物（如凝血酶及溶菌酶）的浓度中的应用，其中靶标分析物种类包含但不局限于凝血酶及溶菌酶。

所述的应用，在实现混合样品中凝血酶、溶菌酶两者各自的浓度测定时，先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50~100mg/ml），再加入凝血酶、溶菌酶或两者共存的待测样品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=545nm及λem=660nm处的荧光强度，并代入已建立的凝血酶及溶菌酶的标准工作曲线，根据荧光强度与凝血酶、溶菌酶的浓度成正比的关系，计算得到混合样品中凝血酶或溶菌酶的浓度，其中所用缓冲液为300mmnacl、20mmtris-hcl、0.1%tween20、ph8.3的混合溶液，该荧光探针检测凝血酶及溶菌酶的线性范围分别为0.02~30nm及0.05~40nm。

本发明的有益效果：

1）该双荧光传感探针的制备过程简单、条件温和，检测速度快、灵敏度高、检出限低。

2）本发明所制备的双荧光探针可实现复杂样品中两种或多种靶标分析物的同时识别及检测，大大提高了分析效率，降低了检测成本。

3）通过在硅纳米微球表面修饰其它不同种类靶标分析物的核酸适配体，制备所得的双荧光探针可实现复杂样品中其它多种靶标分析物的同时检测。

附图说明

图1是实施例1中制备的表面修饰有凝血酶及溶菌酶核酸适配体的硅纳米微球的高分辨扫描电镜图。

图2是实施例1中制备的荧光探针检测实际样品中凝血酶含量的荧光光谱图。

图3是实施例3中制备的将标记有cdteqds及cy5染料的核酸适配体修饰于硅纳米微球表面后，制备的双荧光探针的荧光光谱图。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。

实施例1：一种基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光传感探针的制备方法和应用

具体制备过程包括如下步骤：

①硅纳米微球的制备：将30μl四乙氧基硅烷(teos)溶于15ml的乙醇中，在2000rpm搅拌下，逐滴加入由水10ml、乙醇5ml、氢氧化胺0.2ml所组成的混合溶液，混合物室温搅拌数小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤。所得沉淀中加入溶有20μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的乙醇溶液10ml，混合物室温反应4h，冷却到室温后，所得硅纳米微球用乙醇和乙腈离心洗涤后40℃烘干24h；

②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补dna单链修饰在硅纳米微球表面：上述洗涤后的硅纳米微球，溶于硼酸缓冲液（50.0mm硼酸，3.0mm硼砂，ph=8.5）和nacl（2m）的混合液中，得到浓度为50mg/ml的硅纳米微球溶液。先加入20μl的3’端修饰有羧基的凝血酶核酸适配体互补的dna单链（50nm），混合溶液中加入40μl的n-羟基丁二酰亚胺（nhs）溶液（0.5mg/ml），反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补dna单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，可计算出与凝血酶的核酸适配体互补的dna链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入20μl的3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补dna单链（50nm），混合溶液中加入40μlnhs溶液（0.5mg/ml），反应30-50min后，高速（10000rpm）离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，可计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的dna链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补dna单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液（ph=8.5）和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；

③基于核酸适配体的双荧光探针的制备：固定有两种核酸适配体互补dna单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，得到的溶液中硅纳米微球浓度为100mg/ml，先加入20μl的5’端修饰cy5的凝血酶适配体50nm，在室温下振荡反应小时后，再加入20μl的5’端修饰cdteqds的溶菌酶适配体50nm，在室温下振荡反应0.5~2小时，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针；

④凝血酶含量测定的标准工作曲线：先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50mg/ml），再分别加入10nm的凝血酶溶液0ml，0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml，20ml，50ml，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=660nm处的荧光强度，绘制凝血酶浓度与荧光强度的标准工作曲线待用，其中所用缓冲液为300mmnacl，20mmtris-hcl，0.1%tween20的混合溶液，ph8.3；

⑤实际样品中的凝血酶含量检测：在实际样品中凝血酶浓度测定时，先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50mg/ml），再加入含有凝血酶的待测实际样品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=660nm处的荧光强度，并代入上述步骤④已建立的凝血酶含量测定的标准工作曲线中，根据荧光强度与凝血酶浓度成正比的关系，计算得到混合样品中凝血酶的浓度，其中所用缓冲液为300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液,ph8.3。

实施例2：一种基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光传感探针的制备方法和应用

实验条件和操作步骤与实施例1部分相同，改变的条件如下：

④溶菌酶含量测定的标准工作曲线：先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50mg/ml），再分别加入10nm的溶菌酶溶液0ml，0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，10ml，20ml，50ml，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=545nm处的荧光强度，绘制溶菌酶浓度与荧光强度的标准工作曲线待用，其中所用缓冲液为300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3；

⑤实际样品中的溶菌酶含量检测：在实际样品中溶菌酶浓度测定时，先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50mg/ml），再加入含有溶菌酶的待测实际样品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=540nm处的荧光强度，并代入已建立的溶菌酶标准工作曲线，根据荧光强度与溶菌酶浓度成正比的关系，计算得到混合样品中溶菌酶的浓度，其中所用缓冲液为300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3。

实施例3：一种基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光传感探针的制备方法和应用

实验条件和操作步骤与实施例1部分相同，改变的条件如下：

⑤实际样品中的凝血酶和溶菌酶含量同时检测：在实际样品中凝血酶和溶菌酶的浓度测定时，先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50mg/ml），再加入含有凝血酶和溶菌酶的待测实际样品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=545nm及λem=660nm处的荧光强度，并代入实施例1和实施例2中分别已建立的凝血酶和溶菌酶测定的标准工作曲线，根据凝血酶和溶菌酶的荧光强度与浓度成正比的关系，计算得到混合样品中凝血酶及溶菌酶的浓度，其中所用缓冲液为300mmnacl,20mmtris-hcl,0.1%tween20的混合溶液，ph8.3。

附图1所示为实施例1中经过步骤①、②制备所得的表面修饰有两种不同靶标分析物的核酸适配体的硅纳米微球的sem图，从sem图中可看到该硅纳米微球的粒径约为200nm左右，但是并不能直观看到硅纳米微球表面修饰的核酸适配体链。

附图2所示为实施例1中制备所得的表面修饰有溶菌酶及凝血酶的核酸适配体的双荧光探针应用于凝血酶含量测定的荧光光谱图。从图中可以看出，随着凝血酶浓度的增加，离心后上清液的荧光强度值增大，这是由于随着凝血酶的浓度增多，标记着cy5的凝血酶适配体会不断地从荧光探针表面解离下来，离心后测得的上清液荧光强度值会逐级增强。（荧光分光光度计：horiba，日本，fluoromax-4；激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，激发波长设定在400nm，在450-750nm范围内记录荧光发射光谱的实验数据，光电培增管的电压为950v）。

附图3所示为实施例3中制备所得的表面修饰有两种不同靶标分析物的核酸适配体的双荧光探针的荧光光谱图。