一种用于检测酪氨酸的电化学传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种用于检测酪氨酸的电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

酪氨酸属于芳香类氨基酸，是合成有机体内多种生成物的原料。酪氨酸虽是人体一种非必需的氨基酸，但它在机体内可通过不同代谢途径转化为不同的生理物质，对神经处于高度紧张，身体处于极度严寒、疲惫以及长时间工作的人群有很大的帮助。酪氨酸在许多领域发挥着重要作用，例如在医学方面中，可用于医治骨髓灰质炎、甲状腺功能缺陷等症状，还可用于治疗焦急忧虑、心情郁闷、皮肤性过敏、头痛等症，帮助黑色素的制造、减轻白癜风等症状；同时有助于防止细胞老化，维持身体健康。在食品领域中，常被用于食品和饮料的营养增补剂以及作为保鲜剂用于罐头食品。总之，酪氨酸在食品、医药以及化工等领域应用极为广泛。因此，对开展酪氨酸的定量检测在临床诊断、保障食品和药品安全等方面有着重要作用。

目前，测量酪氨酸方法主要有微生物转化法、微生物发酵法、化学合成法、化学发光法和离子色谱法等。这些方法虽然很重要，但都有一定的局限性。比如微生物转化法易受酶活性影响导致稳定性差，微生物发酵法的代谢途径调控机制复杂，化学合成法工艺较复杂，化学发光法选择性差且对环境体系的各种因素要求极高，离子色谱法受ph影响大、酸碱忍耐度差。而电化学分析法能克服上述传统测定方法的缺点，且具有测定时间短、易操作、不需要前处理、低碳、投资小等优势，酪氨酸自身具有电氧化活性这一特点也有利于其的电化学定量检测。电化学测定方法中用到的工作电极若未经修饰直接使用，其较低的电催化活性将导致分析物的电化学响应信号弱，灵敏度和检出限达不到痕量检测要求。通常，将工作电极进行化学修饰以达到增强电化学响应的目的。目前用于酪氨酸的定量检测的化学修饰电极有：树枝状铜修饰电极(检测范围为2.0×10^-6～5.0×10^-3mol/l、检出限为6.0×10^-7mol/l，王晓岗等,化学世界,2014,7(7):400-404)、聚苏木精修饰电极(检测范围为5.0×10^-6～1.0×10^-4mol/l、检出限为3.0×10^-7mol/l，许春萱等,分析试验室,2011,30(7):87-90)、电还原氧化石墨烯修饰电极(检测范围为5×10^-7～8.0×10^-5mol/l、检出限为2.0×10^-7mol/l，dengkqetal,colloids&surfacesbbiointerfaces,2013,101:183-18)、铕铁氰化物膜修饰电极(检测范围为1×10^-5～6.0×10^-4mol/l、检出限为8.0×10^-6mol/l，liuyetal,appliedsurfacescience,2010,256(10):3148-3154)等。鉴于电化学方法的灵敏性，这些修饰电极检测的结果还有进一步的提升空间。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于检测酪氨酸的化学修饰电极以及电化学传感器。所述的化学修饰电极以及电化学传感器具有较宽的检测范围和较低的检出限。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种用于检测酪氨酸的化学修饰电极的制备方法，包含如下步骤：

(1)取40～60mg氮掺杂石墨烯(n-rgo)，用40～60ml水分散均匀，形成溶液1；

(2)分别取10～11gk4[fe(cn)6]和0.7～0.8gkcl用8～12mlhcl溶解，形成溶液2；

(3)分别取0.1～0.2gfecl3和0.7～0.8gkcl用8～12mlhcl溶解，形成溶液3；

(4)在30～40℃水浴中，以300～600μl/min的速率同时往溶液1里面滴加溶液2和溶液3，滴加结束后，搅拌20～60min；

(5)将步骤(4)得到的反应液分离、洗涤、干燥后得普鲁士蓝/氮掺杂石墨烯纳米复合材料(pb/n-rgo纳米复合材料)；

(6)取2～5mg普鲁士蓝/氮掺杂石墨烯纳米复合材料分散在4～8mln,n-二甲基甲酰胺中，取5～8μl该分散液涂覆在洗净的直径为2～5mm玻碳电极的表面，烤干后得用于检测酪氨酸的化学修饰电极(pb/n-rgo化学修饰电极)。

优选地，步骤(1)中取45～55mg氮掺杂石墨烯(n-rgo)，用45～55ml水分散均匀，形成溶液1。

最优选地，步骤(1)中取50mg氮掺杂石墨烯(n-rgo)，用50ml水分散均匀，形成溶液1。

优选地，步骤(2)中分别取10.2～10.6gk4[fe(cn)6]和0.72～0.76gkcl用8～12mlhcl溶解。

最优选地，步骤(2)中分别取10.423gk4[fe(cn)6]和0.7455gkcl用10mlhcl溶解。

优选地，步骤(3)中分别取0.15～0.2gfecl3和0.7～0.75gkcl用8～12mlhcl溶解。

最优选地，步骤(3)中分别取0.162gfecl3和0.7455gkcl用10mlhcl溶解。

优选地，步骤(4)中在35℃水浴中，以500μl/min的速率同时往溶液1里面滴溶液2和溶液3，滴加结束后，搅拌30min。

优选地，步骤(6)中取3mg普鲁士蓝/氮掺杂石墨烯纳米复合材料分散在5mln,n-二甲基甲酰胺中，取6μl该分散液涂覆在洗净的直径为3mm的玻碳电极的表面。

一种由上述制备方法制备得到的用于检测酪氨酸的化学修饰电极。

对于使用纳米复合材料制备测定具体某种化学成分含量的电极，则需要发明人根据具体待测定的化学物质的性质制备不同的纳米复合材料。制备出的电极对所要测定物质的检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的好坏主要由纳米复合材料的制备方法决定。纳米复合材料的制备方法主要包括原材料的选择、原材料的配比，以及各个步骤反应条件等。对于用作电极的纳米复合材料，其制备方法中原材料的选择、配比以及各个步骤反应条件的不同都会导致后续制备得到的电极电性能的巨大差异，从而导致检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的巨大差异。

根据酪氨酸的特性，为得到具有低检出限的酪氨酸检测电极，本发明发明人通过大量的实验，不断调整原料组成、配比以及制备过程中的工艺参数；制备得到粒径为50～120nm的普鲁士蓝纳米粒子并成功地将其高分散地负载在氮掺杂石墨烯上，该过程将成功增加复合纳米材料的比表面积和催化活性，使得制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极具有优异的电化学响应性能，可以显著降低样品中酪氨酸的检出限，以及提高检测的灵敏度、稳定性与抗干扰性。

一种用于检测酪氨酸的电化学传感器，其包含上述用于检测酪氨酸的化学修饰电极。

优选地，所述的用于检测酪氨酸的电化学传感器，其以上述用于检测酪氨酸的化学修饰电极为工作电极，ag-agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用三电极法组装电极测试体系后连接电化学工作站得用于检测酪氨酸的电化学传感器。

一种酪氨酸的定量检测方法，其使用上述电化学传感器，用差分脉冲伏安法检测样品中的酪氨酸的含量。

优选地，所述的定量检测方法，具体包含如下步骤：

配置待测样品溶液；

使用上述电化学传感器，用差分脉冲伏安法测定待测样品溶液中酪氨酸的氧化峰电流值，根据线性方程换算出酪氨酸的浓度，进而得出样品中酪氨酸的含量；

所述线性方程为ip＝1.65589×10^-6logc+1.15645×10^-5(r²＝0.9904)；方程中c为酪氨酸浓度，ip为差分脉冲伏安法得到的氧化峰电流值；

所述的差分脉冲伏安法的检测条件为以ph为5.0的磷酸缓冲液为底液，搅拌富集时间为10s，静止时间2s；所述的差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。

有益效果：(1)本发明提供了一种全新的用于酪氨酸定量检测的化学修饰电极以及电化学传感器，该电极或传感器对酪氨酸具有优异的电催化活性；(2)所述的用于酪氨酸定量检测的化学修饰电极或电化学传感器具有极低的检出限(实施例表明其检出限为2.086×10^-10mol/l，远远低于现有技术中的6.0×10^-7mol/l、3.0×10^-7mol/l、2.0×10^-7mol/l和8.0×10^-6mol/l)和较宽的检测范围(1.0×10^-8～8.0×10^-4mol/l，宽于现有技术中的5.0×10^-6～1.0×10^-4mol/l、5×10^-7～8.0×10^-5mol/l和1×10^-5～6.0×10^-4mol/l)以及良好的稳定性、抗干扰性和重现性；(3)基于本发明构建的酪氨酸电化学传感器操作简单、成本低廉，在药品质量控制、食品安全和临床医疗等方面有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为n-rgo(a)和本发明所述的pb/n-rgo纳米复合材料(b)的扫描电镜图。

图2为n-rgo(a)和本发明所述的pb/n-rgo纳米复合材料(b)的红外光谱图(a)和紫外光谱图(b)。

图3为本发明所述的pb/n-rgo纳米复合材料的能谱图。

图4为裸电极(a)、n-rgo修饰电极(b)和本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极(c)在5.0mmol/lk3[fe(cn)6]和0.1mol/lkcl底液中的交流阻抗(a)和循环伏安图(b)。

图5为裸电极(a)、n-rgo修饰电极(b)和本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极(c)在0.04mmol/l酪氨酸溶液中的循环伏安图(a)和本发明所述的pb/n-rgo复合膜修饰电极在空白磷酸缓冲液(a)和含0.04mmol/l酪氨酸溶液(b)中的循环伏安图(b)。

图6为不同浓度的酪氨酸在pb/n-rgo化学修饰电极上的差分脉冲伏安图(a)和酪氨酸氧化峰电流与其浓度对数值之间的线性关系图(b)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1用于检测酪氨酸的化学修饰电极的制备

(1)取50mg氮掺杂石墨烯(n-rgo)，加入50ml水超声20min分散均匀，形成溶液1；

(2)分别取10.423gk4[fe(cn)6]和0.7455gkcl加入到10mlhcl中搅拌溶解形成溶液2；

(3)分别取0.162gfecl3和0.7455gkcl加入到10mlhcl中搅拌溶解形成溶液3；

(4)在35℃水浴中，以500μl/min的速率同时往溶液1里面滴加溶液2和溶液3，滴加结束后，继续搅拌30min；

(5)取出上述反应液离心分离，用水洗3次后再次离心分离，60℃烘箱中干燥10h后即可得到普鲁士蓝/氮掺杂石墨烯纳米复合材料(pb/n-rgo纳米复合材料)；

(6)取3mgpb/n-rgo纳米复合材料在5mln,n-二甲基甲酰胺中超声分散后，取分散液6μl涂覆在洗净的玻碳电极(直径为3mm)的表面，在红外灯下烤干得用于检测酪氨酸的化学修饰电极(pb/n-rgo化学修饰电极)。

图1显示的是n-rgo(a)和步骤(5)制备得到的pb/n-rgo纳米复合材料(b)的扫描电镜图。从图1(a)可以看到n-rgo具有典型的弯曲褶皱状结构，从图1(b)可以清楚地观察到颗粒状的普鲁士蓝颗粒附着在弯曲褶皱的片状石墨烯上面，表明该pb/n-rgo纳米复合材料已被成功制备。图2(a)为n-rgo(a)、pb/n-rgo(b)的红外光谱图，两图中主要峰相似，但是pb/n-rgo在1950cm^-1处出现明显的普鲁士蓝的特征峰；图2(b)为n-rgo(a)、pb/n-rgo纳米复合材料(b)的紫外光谱图，比较发现普鲁士蓝在350nm处出现明显的紫外特征峰；证实了普鲁士蓝负载在氮掺杂石墨烯上。图3显示了步骤(5)制备得到的pb/n-rgo纳米复合材料的能谱图。从图3可知，目标产物中主要含有c、o、fe等元素，进一步证实成功合成了pb/n-rgo纳米复合材料；其它元素如k是合成过程中由反应物引入的，对材料的使用性能无影响。

实施例2一种用于检测酪氨酸的电化学传感器

将实施例1制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极作为工作电极，以ag-agcl为参比电极、铂丝电极为辅助电极组装成三电极测试体系，并连接电化学工作站得用于检测酪氨酸的电化学传感器。

实施例3用于检测酪氨酸的化学修饰电极或电化学传感器的电学性能测试

(1)不同电极的电子传递性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以裸玻碳电极(a)、n-rgo修饰电极(b)和实施例1制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极(c)为工作电极在5.0mmol/lk3[fe(cn)6]混合了0.1mmol/lkcl的底液中进行交流阻抗和循环伏安测试。交流阻抗测试条件为：频率范围10⁵～0.1hz、振幅5mv、电位0.17v；循环伏安测试条件为：电位范围-0.2～0.6v，扫描速度0.1v/s，测试结果如图2。从图2(a)可见电化学阻抗在上述裸电极、n-rgo修饰电极和pb/n-rgo化学修饰电极上分别为1800ω、500ω和150ω，从图2(b)可见氧化峰电流在上述三种工作电极分别为5μa、35μa和200μa，结果表明探针离子在本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极上的阻抗值最小、氧化峰电流最大，说明n-rgo上负载pb纳米粒子后其电子传递性能和催化活性得到极大增强。

(2)不同电极对酪氨酸的电催化性能对比

在如实施例2制备得到的三电极测试体系中，分别以裸玻碳电极(a)、n-rgo修饰电极(b)和实施例1制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极(c)为工作电极在0.04mmol/l酪氨酸溶液中的循环伏安测试，测试的电位范围为-0.2～1.2v、扫描速度为0.1v/s，图5(a)为测试结果。从图中可见酪氨酸在本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极上的氧化峰电流为55.16μa，峰电位为0.851v。酪氨酸在n-rgo修饰电极和裸玻碳电极上的氧化峰电流分别为20.20μa和4.56μa，氧化峰电位分别为0.878v和0.915v。酪氨酸在本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极上的氧化峰电流值最大，氧化超电势分别下降了27mv和64mv，说明了本发明所制备的pb/n-rgo化学修饰电极对酪氨酸有着最好的电催化活性，有利于提高传感器的检测灵敏度。图5(b)为本发明所述的pb/n-rgo化学修饰电极在空白磷酸缓冲液(a)和含0.04mmol/l酪氨酸溶液(b)中的循环伏安图。从该图可知，pb/n-rgo化学修饰电极本身在pbs溶液中于1.10v处有pb的氧化峰，而当溶液中含有酪氨酸时会在0.851v处出现一新的氧化峰，即可证实该峰即为酪氨酸的氧化峰，利用该峰可对酪氨酸进行定量检测。

(3)本发明制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极对酪氨酸的检测性能测试

以实施例1制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极为工作电极、ag-agcl电极为参比电极和铂丝电极为辅助电极，利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)；在ph为5.0的磷酸缓冲液中，富集10s，静止2s后对一系列酪氨酸溶液进行差分脉冲伏安法测试。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。结果表明(见图6)酪氨酸的氧化峰电流随其浓度增加而增大，在1.0×10^-8～8.0×10^-4mol/l浓度范围内酪氨酸氧化峰电流与其浓度的对数值呈良好的线性关系，线性方程为：ip＝1.65589×10^-6logc+1.15645×10^-5，相关系数r²＝0.99039，该方程中c为酪氨酸浓度，ip为差分脉冲伏安法得到的氧化峰电流值。检出限利用下面方程得到：

dl＝ksb/r

上式中，dl为检出限；sb为空白液测定20次所得信号标准偏差，实验中测得标准偏差为8.625×10^-11；k为置信系数，通常k取3；r为方法的灵敏度；经计算可得检出限为2.086×10^-10mol/l。说明本发明所制备得到的电极具有良好的线性关系和极低的检出限。

(4)本发明制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极的稳定性和重现性测试

按照实施例1的步骤制备10支相同的pb/n-rgo化学修饰电极，分别以这10支电极为工作电极、ag-agcl为参比电极和铂丝电极为辅助电极，用三电极法组装电极测试系统并连接电化学工作站(构建方法如实施例2所示)，在ph为5.0的磷酸缓冲液中，富集10s，静止2s，利用差分脉冲伏安法对同一浓度的酪氨酸进行测定。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s，测定结果的相对标准偏差为3.66％。将其中一支bp/n-rgo修饰电极保存在4℃冰箱中，选取10个不同的时间段(保存前测试第1次，然后每隔2天测试1次)，利用上述同样条件和方法对同一浓度的酪氨酸进行测定，测定的相对标准偏差为2.35％；表明本发明提供的pb/n-rgo化学修饰电极具有较好的稳定性和重现性。

(5)本发明制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极的抗干扰能力测试

将实施例1制备得到的pb/n-rgo化学修饰电极利用三电极法组装电极测试体系，并连接电化学工作站构成电化学传感器(构建方法如实施例2所示)，利用差分脉冲伏安法考察了外来干扰物质对酪氨酸测定的影响。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。具体测试方法是，在4.5ml磷酸底液中加入0.5ml1mmol/l的酪氨酸，调节底液ph为5.0，在富集10s、静止2s后通过差分脉冲伏安法测定其氧化峰电流值，再加入0.5ml1mol/l(或10mol/l)的干扰物质，通过差分脉冲伏安法测定酪氨酸的氧化峰电流值。对比加入干扰物质前后酪氨酸的氧化峰电流值的变化情况，如果偏差在±5％以内，可以认为干扰物对分析物的检测无影响。测试结果表明，本发明所制备的传感器在10倍的葡萄糖、草酸、vb1、kcl、fecl3以及1倍的色氨酸，腺嘌呤，抗坏血酸、扑热息痛和香草醛等物质的干扰下对酪氨酸的检测值偏差在±5％以内，说明本发明提供的pb/n-rgo化学修饰电极具有较好的抗干扰能力，能有效地对酪氨酸进行定量检测。

实施例4酪氨酸的定量检测方法

(1)配置待测样品溶液；

(2)使用实施例2所述的电化学传感器，用差分脉冲伏安法测定待测样品溶液中酪氨酸的峰电流值，根据线性方程换算出酪氨酸的浓度，进而得出样品中酪氨酸的含量；

所述线性方程为ip＝1.65589×10^-6logc+1.15645×10^-5(r²＝0.9904)；方程中c为酪氨酸浓度，ip为差分脉冲伏安法得到的氧化峰电流值；

所述的差分脉冲伏安法的检测条件为以ph为5.0的磷酸缓冲液为底液，搅拌富集时间为10s，静止时间2s；所述的差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。

实施例5实际样品检测

称取0.9684g葡萄干和1.1260g花生米为实际样品进行酪氨酸的定量检测，将实际样品碾碎后分别加入20ml醋酸溶液浸泡24h后备用。分别取准备好的样品溶液0.2ml，加入5ml磷酸缓冲液并调整ph为5.0后进行差分脉冲伏安测试，差分脉冲伏安测试的操作条件为：电位扫描范围0.0～1.1v、电位增量4mv、振幅50mv、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。先在样品溶液中扫描测定一组数据后，再分别在葡萄干样品液中加入0.5ml浓度为10umol/l的和1.0ml、1.5ml浓度为20umol/l的酪氨酸标准液；在花生米样品液中加入0.5ml浓度为1umol/l的和1.0ml、1.5ml浓度为2umol/l的酪氨酸标准液进一步进行差分脉冲伏安测试。测定结果显示测样品溶液有氧化峰电流出现，该峰电流值随着酪氨酸标准溶液的加入而不断增大且呈线性关系，说明葡萄干和花生米样品中含有酪氨酸且能利用pb/n-rgo化学修饰电极进行测定。通过样品溶液中得到的标准加入曲线的延长线与浓度轴的交点，可求得酪氨酸在葡萄干中的含量为9.65×10^-6mol/l、在花生米中的含量为9.21×10^-6mol/l；说明了本发明提供的化学修饰电极或电化学传感器可用于食品、药品等物质中酪氨酸含量的定量检测。