一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法与流程

本发明涉及火麻仁蛋白质的研究领域，特别涉及一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法。

背景技术：

火麻仁为桑科植物大麻的干燥成熟果实。别名又叫大麻仁、火麻、线麻子。火麻仁是典型的药食同源物，在中国作为药食同源已经有3000年历史，我国各地均有栽培，也有半野生者，广泛分布于东北、华北、华东、中南等地。资源丰富，富含优良的营养价值和具有多种多样的药理作用，具有较高的经济价值、医用价值和开发应用前景。

火麻仁始载于《神农本草经》，列为上品。其性味甘平，有润肠通便之功效，麻仁养阴生津，临床上用于治疗血虚津亏，肠燥便秘等。现代研究表明，火麻仁中含有25%-35%油脂、20%-25%蛋白质、20%-30%的膳食纤维，还含有丰富的维生素（vb、ve、vk）和矿物质（ca、fe、na、mg、zn）；有较好的降血压、利尿、镇痛、抗炎、抗血栓形成的作用，长期食用，对慢性神经炎、瘫痪、便秘、降血压、降血脂、抗溃疡以及妇科疾病具有很好的补助疗效。

火麻仁蛋白是一种十分优异的植物蛋白质新来源，属于易消化的膳食性蛋白质，火麻仁蛋白质含有以谷氨酸、组氨酸和精氨酸等为主的21种氨基酸，必需的氨基酸比例合理，属于优质完全蛋白质。经临床试验证明，火麻仁蛋白质具有提高耐缺氧、改善贫血等功效。但是火麻仁蛋白质的结构比较紧密，溶解性较差，用酶直接对其进行水解比较难接触其酶切位点，作为保健品其生物效价不理想，因此，改善火麻仁蛋白质的结构，有利于提高其营养和功能特性，增加其附加值。

目前，改善蛋白质结构和功能性质的方法有酶法水解、超高压处理、热诱导聚合、基因工程技术等，这些方法分别存在成本高、设备要求高、操作条件不易控制和技术周期长、见效慢等缺点。

因此，发明一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法来解决上述问题很有必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，包括以下步骤：（1）火麻仁的脱脂；（2）火麻仁蛋白的制备；（3）高温和超声波的预处理；（4）酶解经高温和超声波预处理的蛋白样品；（5）清除dpph自由基的能力；（6）总还原力测定；（7）清除羟基自由基ho·能力；（8）金属离子螯合能力的测定；（9）abts阳离子自由基清除法测定；（10）统计分析。

优选的，火麻仁的脱脂包括以下步骤，选取市售去壳火麻仁，将火麻仁置于干燥箱中60摄氏度干燥4小时，接着用粉碎机粉碎，过60目筛，过筛后的原料加入石油醚，机械搅拌2小时脱脂，离心收集沉淀备用，石油醚采用旋转蒸发仪回收。

优选的，火麻仁蛋白的制备包括以下步骤，将脂后的火麻仁原料粉以1:10固液比分散在去离子水中，常温搅拌1小时后，搅拌的过程中不断加入1mol/l氢氧化钠调节ph至8.5，用离心机4000rpm/min离心20min后分离去除沉淀，将所得溶液用1mol/l盐酸调ph4.5，静置5min后，用离心机4000rpm/min离心20min后分离出酸沉蛋白，用去离子水洗涤2次，使其在水中形成蛋白分散液，再用1mol/l氢氧化钠调ph值至7.0，将所得酸沉蛋白分散液经冷冻干燥后即为火麻仁蛋白。

优选的，高温和超声波的预处理包括以下步骤，将火麻仁蛋白分散在磷酸盐缓冲溶液中配制成1%的蛋白溶液，搅拌使火麻仁蛋白完全溶解，然后使用超声波细胞粉碎机对溶液进行处理，设置超声强度分别为200w、400w、600w，超声时间均为20min，超声开时间2s，超声关时间1s，此外设置一个对照样本，常压下高温预处理，配制5%的蛋白溶液100℃水浴加热30min，然后冷却到室温，高温和超声波预处理的样品均冻干并储存于干燥器中。

优选的，酶解经高温和超声波预处理的蛋白样品包括以下步骤，定量称取蛋白质后用蒸馏水配制成5%的蛋白溶液，用0.5mol/l的氢氧化钠将其ph值调节到9.0，用50℃水浴加热，再加入碱性蛋白酶酶解，此过程中使用0.5mol/l氢氧化钠溶液和0.1mol/l盐酸溶液控制酶解液恒定的ph值，酶解6小时后反应结束，酶解物在100℃水中煮沸15min以使酶失活，冷却至室温，用1mol/l盐酸溶液调ph为4.5，然后用离心机4000r/min离心20min，收集上清液冻干备用。

优选的，清除dpph自由基的能力包括以下步骤，取0.3ml不同浓度的样品溶液添加到2.7ml0.0001mol/ldpph新鲜配制的乙醇溶液中，用力混合均匀，反应混合物在室温黑暗中放置30min后，用紫外-可见分光光度计在517nm测定吸光度，用没有加样品的dpph乙醇溶液作为空白对照，抑制率可用以下公式表示：

抑制率%=

式中：at=0代表空白的吸光度；

at=30min代表加入水解液后保温30min的吸光度。

优选的，总还原力测定包括以下步骤，取1ml样品溶液分别与2.5ml磷酸缓冲液和2.5ml铁氰化钾溶液混合，混合物在50℃保温20min，然后加入2.5ml10%三氯乙酸，用离心机在3000r/min离心10min，离心结束后吸取2ml上清液于试管中，再加入2.5ml蒸馏水和0.5ml氯化铁，混合均匀，用蒸馏水做参照，紫外分光光度计在700nm测定其分光光度值，高的吸光度表示强的还原力。

优选的，清除羟基自由基ho·能力包括以下步骤，在10ml试管中依次加入6mmol／l的硫酸亚铁1ml和6mmol／l水杨酸-乙醇1ml后，把不同浓度的样液1ml分别加入试管中，然后加入1ml0.1％的过氧化氢，用蒸馏水补足总体积为5ml，其中对照管不加样液，样底管不加，摇匀后在37℃水浴中保温30min，用紫外分光光度计测510nm处的吸光度值，清除率计算公式为：

清除率%=

式中：：不加水解液时羟自由基体系的吸光度值；

：加入水解液的羟自由基体系的吸光度值；

：羟自由基反应体系中不加而加水解液的吸光值。

优选的，金属离子螯合能力的测定包括以下步骤，1.0ml样品溶液中加入0.05ml2mmol/ml氯化亚铁溶液以及1.85ml蒸馏水，再加入0.1ml5mmol/ml菲啰嗪混合，将混合物用力摇匀并在室温下放置10min，然后用紫外分光光度计在562nm测定其吸光度，低的吸光度表示多肽对二价铁离子有强的螯合能力，金属离子螯合能力的计算公式如下：

螯合率%=（1-a/a0）×100

式中：a：表示样品吸光度；

a0：表示不加水解液而用1ml蒸馏水代替样品测定的吸光度。

优选的，abts阳离子自由基清除法测定包括以下步骤，abts用2.45mmol过硫酸铵配制成7mmol的溶液，使用前用蒸馏水稀释使得吸光度为0.7，不同浓度的样液0.5ml与3mlabts溶液混匀，在734nm处测吸光度值，清除率计算公式为：

清除率%=[1-()/]×100

式中：：0.3ml蒸馏水与0.5ml多肽溶液混合所测吸光度值；

:0.3mlabts溶液与0.5ml多肽溶液混合所测吸光度值；

：abts溶液实际吸光度值。

同时配制不同浓度的谷胱甘肽溶液，按照上述方法测定谷胱甘肽的抗氧化能力，即以谷胱甘肽作阳性对照。

优选的，统计分析包括以下步骤，所有的实验重复三次，用单因子方差分析进行差异显著性检验，结果表示为平均值±标准偏差，数据统计分析采用spss软件进行。

本发明的技术效果和优点：超声波技术具有作用时间短、操作简单易控制及能耗较低等优点，并且已有研究表明，超声波功率提高时，其对介质产生的空穴效应、机械效应等作用增强，使得蛋白质分子伸展，有助于蛋白质疏水性氨基酸外露，增加蛋白酶切位点，减少酶解时间，从而提高酶解效率。因此通过测定超声处理后的蛋白质酶解物的功能特性、抗氧化活性，可以知道超声波处理是否能够提高酶解效率，对火麻仁蛋白质的研究和开发利用具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明清除dpph自由基的能力示意图；

图2为本发明总还原力测定示意图；

图3为本发明清除羟基自由基ho·能力示意图；

图4为本发明金属离子螯合能力的测定示意图

图5为本发明abts阳离子自由基清除法测定示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种火麻仁蛋白水解物抗氧化活性的研究方法，包括以下步骤：（1）火麻仁的脱脂；（2）火麻仁蛋白的制备；（3）高温和超声波的预处理；（4）酶解经高温和超声波预处理的蛋白样品；（5）清除dpph自由基的能力；（6）总还原力测定；（7）清除羟基自由基ho·能力；（8）金属离子螯合能力的测定；（9）abts阳离子自由基清除法测定；（10）统计分析。

火麻仁的脱脂包括以下步骤，选取市售去壳火麻仁，将火麻仁置于干燥箱中60摄氏度干燥4小时，接着用粉碎机粉碎，过60目筛，过筛后的原料加入石油醚，比例为1:10，机械搅拌2小时脱脂，离心收集沉淀备用，石油醚采用旋转蒸发仪回收；火麻仁蛋白的制备包括以下步骤，将脂后的火麻仁原料粉以1:10固液比分散在去离子水中，常温搅拌1小时后，搅拌的过程中不断加入1mol/l氢氧化钠调节ph至8.5，用离心机4000rpm/min离心20min后分离去除沉淀，将所得溶液用1mol/l盐酸调ph4.5，静置5min后，用离心机4000rpm/min离心20min后分离出酸沉蛋白，用去离子水洗涤2次，使其在水中形成蛋白分散液，再用1mol/l氢氧化钠调ph值至7.0，将所得酸沉蛋白分散液经冷冻干燥后即为火麻仁蛋白。

高温和超声波的预处理包括以下步骤，将火麻仁蛋白分散在磷酸盐缓冲溶液中配制成1%（w/v）的蛋白溶液，搅拌使火麻仁蛋白完全溶解，然后使用超声波细胞粉碎机对溶液进行处理，设置超声强度分别为200w、400w、600w，超声时间均为20min，超声开时间2s，超声关时间1s，此外设置一个对照样本，常压下高温预处理，配制5%（w/v）的蛋白溶液100℃水浴加热30min，然后冷却到室温，高温和超声波预处理的样品均冻干并储存于干燥器中。

酶解经高温和超声波预处理的蛋白样品包括以下步骤，定量称取蛋白质后用蒸馏水配制成5%（w/v）的蛋白溶液，用0.5mol/l的氢氧化钠将其ph值调节到9.0，用50℃水浴加热，再加入碱性蛋白酶（4%w/v，火麻仁蛋白质含量基础）酶解，此过程中使用0.5mol/l氢氧化钠溶液和0.1mol/l盐酸溶液控制酶解液恒定的ph值，酶解6小时后反应结束，酶解物在100℃水中煮沸15min以使酶失活，冷却至室温，用1mol/l盐酸溶液调ph为4.5，然后用离心机4000r/min离心20min，收集上清液冻干备用。

实施例一：清除dpph自由基的能力包括以下步骤，取0.3ml不同浓度的样品溶液（浓度10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml）添加到2.7ml0.0001mol/ldpph新鲜配制的乙醇溶液中，用力混合均匀，反应混合物在室温黑暗中放置30min后，用紫外-可见分光光度计在517nm测定吸光度，用没有加样品的dpph乙醇溶液作为空白对照，抑制率可用以下公式表示：

抑制率%=

式中：at=0代表空白的吸光度；

at=30min代表加入水解液后保温30min的吸光度。

根据图1所示，随着各样品浓度的升高，各样品清除dpph自由基能力增大，各样品都表现出一定的抗氧化作用，但与传统抗氧化剂相比存在一定的差距，清除自由基的大小依次为hmr＜heated＜超声400w＜超声600w＜超声200w＜gsh，明显可看出超声处理后的火麻仁多肽清除dpph自由基能力高于传统酶解条件下的火麻仁多肽，并且功率在200w的火麻仁蛋白水解物清除率最高，抗氧化活性最强，在400w时有所下降，600w时又有所上升，但均小于200w。

由实施例一可得知：随着各样品浓度的升高，各样品清除dpph自由基能力增大。

实施例二：总还原力测定包括以下步骤，取浓度10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml的1ml样品溶液分别与2.5ml磷酸缓冲液(0.2m，ph6.6)和2.5ml铁氰化钾（1%）溶液混合，混合物在50℃保温20min，然后加入2.5ml10%三氯乙酸，用离心机在3000r/min离心10min，离心结束后吸取2ml上清液于试管中，再加入2.5ml蒸馏水和0.5ml（0.1%）氯化铁，混合均匀，用蒸馏水做参照，紫外分光光度计在700nm测定其分光光度值，高的吸光度表示强的还原力。

根据图2所示，火麻仁蛋白以及不同处理条件下火麻仁多肽均有一定的还原能力，总还原能力的大小依次为hmr＜heated＜超声400w＜超声600w＜超声200w＜gsh，其规律与清除dpph能力的结果一致，随着浓度的升高，各样品总还原力增加，但增加不多，并且与谷胱甘肽相比有较大差距，说明总还原能力比较弱，除去阳性对照，超声波预处理对还原能力的增加有很大帮助，尤其是超声功率在200w情况下，总还原能力最强。

由实施例二可得知：超声波预处理对还原能力的增加有很大帮助，尤其是超声功率在200w情况下，总还原能力最强。

实施例三：清除羟基自由基ho·能力包括以下步骤，在10ml试管中依次加入6mmol／l的硫酸亚铁1ml，6mmol／l水杨酸-乙醇1ml后，把不同浓度的样液（浓度2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml）1ml分别加入试管中，然后加入1ml0.1％的过氧化氢，用蒸馏水补足总体积为5ml，其中对照管不加样液，样底管不加，摇匀后在37℃水浴中保温30min，用紫外分光光度计测510nm处的吸光度值，清除率计算公式为：

清除率%=

式中：：不加水解液时羟自由基体系的吸光度值；

：加入水解液的羟自由基体系的吸光度值；

：羟自由基反应体系中不加而加水解液的吸光值。

根据图3所示，随着各样品浓度的增加，清除羟基自由基ho·的能力越强，与前两组实验相比，火麻仁多肽对羟基自由基的清除能力比较强，在较小浓度就能表现出较强的清除能力，浓度为8mg/ml，超声200w条件下的火麻仁多肽对ho·的清除率就能达到65.1%，其清除能力大小同样是hmr＜heated＜超声400w＜超声600w＜超声200w＜gsh，结果与上述抗氧化实验一致。

由实施例三可得知：随着各样品浓度的增加，清除羟基自由基ho·的能力越强。

实施例四：金属离子螯合能力的测定包括以下步骤，1.0ml样品溶液（浓度分别为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml）中加入0.05ml2mmol/ml氯化亚铁溶液以及1.85ml蒸馏水，再加入0.1ml5mmol/ml菲啰嗪混合，将混合物用力摇匀并在室温下放置10min，然后用紫外分光光度计在562nm测定其吸光度，低的吸光度表示多肽对二价铁离子有强的螯合能力，金属离子螯合能力的计算公式如下：

螯合率%=（1-a/a0）×100

式中：a：表示样品吸光度；

a0：表示不加水解液而用1ml蒸馏水代替样品测定的吸光度。

根据图4所示，火麻仁蛋白水解物均表现出很强的金属（）螯和作用，超声波处理后的火麻仁多肽螯能力高于传统水解的多肽溶液，在浓度1mg/ml时，超声处理过的火麻仁多肽的清除率就已经达到50%以上，随着浓度的升高，螯和能力增强，在相同浓度下，其螯和能力大小同样是hmr＜heated＜超声400w＜超声600w＜超声200w＜gsh，与上述抗氧化实验一致。

由实施例四可得知：随着浓度的升高，螯和能力增强，在相同浓度下，其螯和能力大小同样是hmr＜heated＜超声400w＜超声600w＜超声200w＜gsh。

实施例五：abts阳离子自由基清除法测定包括以下步骤，abts用2.45mmol过硫酸铵配制成7mmol的溶液，使用前用蒸馏水稀释使得吸光度为0.7，不同浓度的样液（浓度2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml）0.5ml与3mlabts溶液混匀，在734nm处测吸光度值，清除率计算公式为：

清除率%=[1-()/]×100

式中：：0.3ml蒸馏水与0.5ml多肽溶液混合所测吸光度值；

:0.3mlabts溶液与0.5ml多肽溶液混合所测吸光度值；

：abts溶液实际吸光度值。

同时配制不同浓度的谷胱甘肽溶液，按照以上方法测定谷胱甘肽的抗氧化能力，即以谷胱甘肽作阳性对照。

根据图5可知，随着各样品浓度的升高，其对abts自由基的清除率也升高，清除能力的大小依次为hmr＜heated＜超声600w＜超声400w＜超声200w＜gsh，与上述抗氧化实验结果有不同之处，主要表现为超声400w＞超声600w，说明随超声功率的提高，火麻仁多肽清除abts阳离子自由基能力增加。

由实施例五可得知：随超声功率的提高，火麻仁多肽清除abts阳离子自由基能力增加。

在本发明的统计分析中，所有实施例中的实验均重复三次，用单因子方差分析进行差异显著性检验，结果表示为平均值±标准偏差，数据统计分析采用spss软件进行。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。