本发明涉及健骨注射液hplc指纹图谱的构建方法。
背景技术：
：马鞭草科植物黄毛豆腐柴(premnafulvacraib)系广西壮族民间药，其商品药材名为“战骨”。健骨注射液收录于1997年版《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》，由战骨制成。中药理论认为，战骨强筋健骨。其制成的注射液具有活血散瘀，强筋健骨，驱风止痛的功效，用于脊椎骨质增生症，证见关节疼痛僵硬，或关节红肿，肢体无力，或局部发麻等。但目前还没有建立标准健骨注射液的指纹图谱质量检测方法。技术实现要素：本发明提供一种健骨注射液hplc指纹图谱的构建方法，并进一步公开了健骨注射液标准hplc指纹图谱的构建方法及其质量检测方法。一种健骨注射液hplc指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：1、供试品溶液的制备：取本品，加20％乙腈，制成按体积比计浓度为10％的供试品溶液；2、对照品溶液的制备：分别取夏佛塔苷、维采宁-2和维采宁-3对照品适量，加20％乙腈制成每1ml含100-200μg夏佛塔苷、150-250μg维采宁-2、50-100μg维采宁-3的混合对照品溶液；3、高效液相色谱法分析，记录指纹图谱，即得：色谱条件为进样量10μl；色谱柱为welchultimatexb-c18；以乙腈为流动相a，0.3％冰乙酸溶液为流动相b；梯度洗脱，洗脱时间0-70min，对应流动相a变化为：10-20％a，流动相b为90-80％；柱温30℃；检测波长340nm。对照品夏佛塔苷、维采宁-2和维采宁-3的浓度依次优选150μg/ml，230μg/ml，70μg/ml。健骨注射液hplc标准指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：1、共有模式图谱的生成：按权利要求1所述的方法，得十批次以上的健骨注射液样品hplc指纹图谱，将图谱导入指纹图谱分析软件，生成共有模式指纹图谱；2、共有峰的确认：对共有模式指纹图谱主要峰进行确认，确定共有特征峰7个，依次为1号峰为维采宁-2、3号峰为夏佛塔苷、4号峰为维采宁-3，2号峰、5号峰、6号峰、7号为芹菜素糖苷类化合物；确认共有峰的共有模式指纹图谱及为所述的标准指纹图谱。所述的共有峰的确认方法具体为：uflc-tripletof-dad-ms/ms技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测及确认；质谱工作参数为：ionsprayvoltage1500v；ionsourcegas150psi；ionsourcegas260psi；temperature550℃；curtaingas15psi；collisiongaspressure8psi；entrancepotential10v；采用esi电喷雾离子源，负离子模式进行检测。健骨注射液的质量检测方法，则包括以下步骤：1、按如上健骨注射液hplc指纹图谱构建方法，建立健骨注射液待测样品指纹图谱；2、对比检测，将所得待测样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，待检样品指纹图谱中，呈现7个对应特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不得低于0.90。本发明方法能对健骨注射成品或半成品的质量进行监控；为健骨注射液的标准化研究提供了科学依据。该方法的重复性、精密性和专属性强。附图说明图1是本发明实施例健骨注射液标准指纹图谱。图2是对照品与健骨注射液标准指纹图谱对应的色谱图。图3是健骨注射液、战骨药材、阴性对照色谱图。图4是本发明实施例不同批次的健骨注射液的检测结果图。图5是健骨注射液、中间体、战骨药材相关性结果图。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1健骨注射液高效液相指纹图谱的确定1仪器与试药1.1仪器：美国dionex公司ultimate3000dglc高效液相色谱仪(dgp-3600sd双三元泵、srd-3600脱气机、wps-3000sl自动进样器、tcc-3000rs柱温箱、dad-3000检测器、chromeleon7.2数据处理软件)；日本日立公司hitachichromaster5430高效液相色谱仪(cm5110四元泵、cmorg脱气机、cm5310柱温箱、cm5210进样器、cm5430dad检测器)；色谱柱：welchultimatexb-c18(4.6×250mm，5μm)。1.2试药：10批成品，均由广西南宁百会药业集团有限公司提供。实验中液相色谱所用试剂乙腈为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。对照品：夏佛塔苷(来源：中国食品药品检定研究院，批号：111912-201302)维采宁-2(来源：sigma，批号：0398-05-85)；维采宁-3(来源：上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：4953)；2.方法与结果2.1健骨注射液hplc指纹图谱的构建方法2.1.1溶液的制备：供试品溶液的制备：取装量差异项下本品1ml，置10ml容量瓶中，加20％乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液的制备：分别取夏佛塔苷对照品、维采宁-2对照品、维采宁-3对照品适量，加20％乙腈制成每1ml含150μg、230μg、70μg的混合对照品溶液。药材供试品溶液的制备：取战骨饮片粉末(过三号筛)约1g，精密加入80％甲醇或40％乙腈25ml，称重，静置30分钟，再超声处理1小时，放冷，用80％甲醇或40％乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.1.2高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μl，进样；色谱条件：色谱柱为welchultimatexb-c18(4.6×250mm，5μm)；流动相为以乙腈为流动相a，0.3％冰乙酸溶液为流动相b，采用以下梯度洗脱方式，见表1：表1检测波长340nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；得到健骨注射液高效液相色谱标准指纹图谱。2.1.3共有峰确定：将上述得到的10批健骨注射液的高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行比较，确定7个共有特征峰并获得共有模式，即标准指纹图谱如图1所示。所得的色谱图检出均归属于战骨。利用uflc-tripletof-dad-ms/ms技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过紫外光谱比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：1号峰为维采宁-2、3号峰为夏佛塔苷、4号峰为维采宁-3，2号峰、5号峰、6号峰、7号为芹菜素糖苷类化合物(芹菜素碳苷类)。以上色谱峰构成了健骨注射液的指纹特征，以3号峰夏佛塔苷为参照物峰，共有峰的相对保留值如表2所示。表22.1.4精密度试验：取同一健骨注射液供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，经评价，相似度均大于0.99，结果表明仪器的精密度良好。相似度结果如表3：表3精密度1精密度2精密度3精密度4精密度5精密度6对照指纹图谱精密度11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度21.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度31.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度41.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度51.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000精密度61.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.1.5重复性试验：取同一批健骨注射液6份，按供试品溶液制备项下方法操作，检测指纹图谱，经评价，相似度均大于0.99，结果表明方法重复性好。相似度结果如表4：表4s1s2s3s4s5s6对照指纹图谱s11.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s21.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s31.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s41.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s51.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000s61.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0002.1.6稳定性考察：取同一健骨注射液供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、36、75h小时进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价，相似度均大于0.99，结果表明供试品溶液放置75小时内稳定。相似度结果如表5：表52.1.7中间精密度：取同一批号的健骨注射液，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价。结果表明该方法中间精密度好，健骨注射液hplc指纹图谱质量控制方法可行。(1)不同分析时间：取同一批号的健骨注射液，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度均大于0.95。相似度结果如表6：表6分析时间1分析时间2对照指纹图谱分析时间11.0001.0001.000分析时间21.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000(2)不同分析人员：取同一批号的健骨注射液，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行评价，相似度大于0.99。相似度结果如表7：表7分析人员1分析人员2对照指纹图谱分析人员11.0001.0001.000分析人员21.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000(3)不同仪器：取同一批号的健骨注射液一份，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别在不同的仪器依法测定，采用“中药色谱指纹图谱相度评价系统”进行评价，相似度均大于0.99。相似度结果如表8：表8分析仪器1分析仪器2对照指纹图谱分析仪器11.0001.0001.000分析仪器21.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.000实施例2利用高效液相指纹图谱检测健骨注射液1仪器与试药：同实施例1。2方法：2.1溶液的制备：同实施例1。供试品溶液的制备：取装量差异项下本品1ml，置10ml容量瓶中，加20％乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液的制备：取夏佛塔苷对照品适量，加20％乙腈制成每1ml含150μg的溶液；取维采宁-2对照品适量，加20％乙腈制成每1ml含230μg的溶液；取维采宁-3对照品适量，加20％乙腈制成每1ml含70μg的溶液，即得。分别取21507001、1603003、1608002、1611001、1611002、tde-0210002、tdo-030701、xl-0306007、1309006、1703003十批次的健骨注射液，按供试品溶液的制备方法制备。在实际检测过程中，并不要求每一次均需配制维采宁-2、夏佛塔苷、维采宁-3的对照品溶液。2.2高效液相色谱及分析方法：同实施例1。2.3不同批次的重复性试验的实施例：在实验过程中，检测过10个批次的健骨注射液，结果表明10批健骨注射液相似系数均大于0.99，证明健骨注射液的生产工艺稳定，产品的均一性较好，相似度评价结果及相似度评价结果如表9：表9表10药材中间体成品对照指纹图谱药材1.0000.9680.9610.980中间体0.9681.0001.0000.998成品0.9611.0001.0000.997对照指纹图谱0.9800.9980.9971.000实施例3利用高效液相指纹图谱检测成品、中间体、药材相关性1仪器与试药：同实施例1。2方法：2.1溶液的制备：健骨注射液供试品溶液：同实施例1.中间体供试品溶液：精密量取本品0.1ml，置10ml容量瓶中，加20％乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。战骨药材供试品溶液：同实施例12.2高效液相色谱及分析方法：同实施例1。2.3样品、中间体、药材的相关性研究：在实验过程中，检测过同一批次的健骨注射液、中间体、药材，结果其相似度系数均大于0.96，证明健骨注射液的生产工艺稳定，产品的相关性较好。健骨注射液-中间体-药材相似度评价结果如上表10。当前第1页12