本发明涉及土壤微生物的科学研究领域，更具体涉及一种研究土壤产甲烷古菌的方法，同时还涉及一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，该装置同样适用于同位素标记和示踪植物有机碳在土壤中的分解与转化。
背景技术：
甲烷（ch4）是重要的温室气体之一，其百年尺度增温潜势是二氧化碳的25倍（ipcc,2007）。ch4在大气中的浓度逐年上升，对全球气候和环境产生了极为严重的威胁。而稻田是重要的ch4排放源之一，其每年的ch4排放量占全球人类活动造成的ch4排放总量10%（nazariesetal.,2013），所以对稻田土壤甲烷排放的研究具有十分重要的意义。稻田甲烷排放是ch4产生过程和ch4消耗过程的净效应（lemerandroger,2001）。ch4产生过程是产甲烷菌在严格厌氧条件下作用于有机肥料、动植物残体、土壤腐殖质以及水稻根系分泌物等土壤有机质的结果。而13c同位素可以对植物和微生物进行标记和示踪，并进一步结合稳定同位素探针技术等分子生物学手段来研究土壤中的产甲烷古菌。
技术实现要素：
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法，该方法简单易行，对产甲烷菌的标记效果好。通过在标记装置内加入13c-co2，植物利用13c-co2进行光合作用，进而合成13c-有机质，部分13c-有机质以根系分泌物的形式分泌到土壤中，产甲烷菌消耗这部分13c-有机质，形成13c-产甲烷菌，通过后续分子生物学手段可将这部分13c-产甲烷菌分离出来，进而了解其群落组成结构。而且本方法能对植物进行单盆同位素标记，减少了不同处理样品间的相互影响。
本发明的另一个目的是在于提供了一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，该装置可以对土壤微生物进行同位素标记。装置结构简单，使用方便；水封的设计更增加了密封效果，外界气体不易进入标记罩内；装置设有浇水口，即使进行长期标记，也能保证植物的正常生长；而且装置小巧，不占用大量空间，在任何实验室均可方便的操作。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法，包括如下步骤：
1）培养盆装土，加去离子水，保持淹水状态，2－4厘米水层；称取1－2kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为10×16cm（直径×高），土层厚度12－14cm。加去离子水，水稻栽培期间一直保持淹水状态，2－4厘米水层。
2）淹水一周后，在盆养盆内移栽水稻幼苗；选取长势相同的水稻幼苗，苗龄为18－22天，移栽至培养盆中，每个盆中移栽4－6株幼苗。
3）在水稻分蘖盛期时，开始标记13c-co2气体。13c-co2是通过13c-碳酸钠溶液（浓度为1m）与硫酸（浓度为2m）反应生成。
4）每天标记时间段为9:00-16:00，每小时标记一次，共标记7天。标记时，用1.5ml注射器吸取1.2ml13c-碳酸钠溶液（1m），通过罩子顶部的三通阀，注射到装有过量硫酸（2m）的塑料小白盒中，13c-碳酸钠液体立即与硫酸反应，生成大约35ml的13c-co2，顶部的小风扇可将罩子内气体混匀，以便水稻充分利用13c-co2进行光合作用。每天从上午9:00到16:00的7个小时内，即光合作用最强的7个小时内，每个小时注射一次，连续标记7天。用同位素质谱仪检测植物，土壤以及气体中13c同位素丰度，来检测该方法的同位素标记效果。
一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，它由pvc管、不锈钢方盘、有机玻璃罩、小白盒（内有硫酸）、硅胶管、标记口、电线、小风扇、采气口、植物、浇水口、培养盆组成，其连接关系是：不锈钢方盘分别与pvc管、有机玻璃罩相连，不锈钢方盘和pvc管相连组成的底座中装有植物，有机玻璃罩顶端与小风扇相连，小白盒与小风扇相连。在有机玻璃罩上开有标记口、采气口、浇水口，第一硅胶管与标记口相连并放置于小白盒内，第二硅胶管与浇水口相连。带插头的电线分别与小风扇和电源相连。
有机玻璃罩尺寸为5mm×15cm×60cm（壁厚×直径×高），在距离罩子两端各18－22cm处，用电钻各打一个小孔，分别插入三通阀，并在接缝处涂704胶，确保密封不透气。上部的三通阀连接一个针头，做为采气口，用于采集罩子内气体；下部的三通阀不接针头，但是与三通阀相连的第二硅胶管延长，可向培养盆内浇水，做为浇水口。有机玻璃罩罩子顶部盖上有机玻璃圆板，并在标记开始前用704胶将圆板与有机玻璃罩罩子密封好，有机玻璃圆板尺寸为5mm×15cm（厚度×直径），在圆板的两侧各打一个小孔，一个插入三通阀，三通阀下端连接第一硅胶管；另一个小孔用于将小风扇的电线扯出。圆板上用有机玻璃胶粘贴四个圆形小帽，圆形小帽中间孔的大小以能拧紧进螺丝钉为宜。晾干后，将小风扇用长螺丝钉固定在圆板上，小风扇的电线从顶部圆板上的小孔中出来，并将接缝处用704胶密封好，小风扇的尺寸为8cm×8cm×2.5cm（长×宽×厚度）。小风扇下方用铁丝固定一个塑料小白盒，小白盒尺寸为6.6cm×9.5cm×6.8cm（底部直径×顶部直径×高），小白盒中注入硫酸（浓度为2m），标记时，从罩子顶部的三通阀注射13c-碳酸钠液体，碳酸钠液体流进小白盒中，反应生成13c-co2。
不锈钢方盘和pvc管相连组成一个底座。不锈钢方盘尺寸为18cm×18cm×3cm（长×宽×高），底部用pvc管支撑，pvc管尺寸为16×20cm（直径×高），不锈钢方盘和pvc管接触区域用704胶密封好。不锈钢方盘中间挖成一个圆形（直径10厘米），将培养盆放入圆形中，接触区域用704胶密封好，晾干后，在不锈钢方盆中加入去离子水，水层二厘米左右。标记时，将有机玻璃罩子罩在不锈钢底座上，通过水封形成一个密闭的系统。
通过以上技术措施，解决了不能对植物进行单盆同位素标记的技术难点。现有技术一般是将所有植物盆栽全部放进一个大的玻璃箱中进行标记，从玻璃箱中采集的气体样品是所有处理混在一起的，而实际上不同处理间气体结果往往差异较大，而本方法和装置可以进行单盆标记，因此可以单独研究不同处理的样品差异。例如在本试验的缺磷处理中，有机玻璃罩内13c-甲烷气体的丰度约8%，而在氮磷钾均衡施肥处理中，玻璃罩内13c-甲烷气体的丰度达到约15%，显示了不同施肥方式下气体结果差异很大，而现有技术检测不到这些差异，本方法和装置却可以有效的解决这一技术问题。此外，本方法和装置也大大提高了对植物和土壤微生物同位素标记的效果，经过7天的连续标记后，水稻植株中13c同位素丰度显著增加，根茎叶中13c同位素丰度由1.08%分别增加至10%，27%，18%，土壤中13c同位素丰度增加至2%。而且本装置设计小巧，不占用大量空间，在任何实验室均可方便的操作，更易推广。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、对植物和土壤微生物的同位素标记效果好：
用本方法和装置进行13c同位素标记后，水稻植株中13c丰度（13c与总碳的比值）显著增加，在根茎叶中分别增加至10%，27%，18%，而且土壤中13c丰度也增加至2%，表明该方法和装置的标记效果好。
2、能进行单盆标记，减小了样品间的相互影响：
以往的原位标记co2试验一般是在一个大的玻璃箱中操作，将所有植物盆栽全部放进去，同时进行标记，但是不同处理的样品间有可能会相互影响。而本装置可以进行单盆标记，大大减少了处理间的污染。
3、采用水封，密封效果好：
在不锈钢方盘加入去离子水，将有机玻璃罩罩上后形成一个密闭的系统，密封效果好，外界气体不易进入标记罩内。
4、设有浇水口，保证植物正常生长：
装置的浇水口由三通阀和硅胶管组成，在标记的七天内，每天用注射器通过三通阀浇水，保证了植物的正常生长，也保证了水稻培养盆内的淹水状态，如果不需要淹水状态，也可自行减少浇水量。
5、装置稳固且小巧：
用不锈钢方盘和pvc管相连形成一个底座，使得装置更加稳固，在标记过程中不易倾倒。而且与其他同位素标记装置相比，本方法的装置小巧，不占用大量空间，在任何实验室均可方便的操作。
附图说明
图1为一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置结构示意图。
1-pvc管、2-不锈钢方盘、3-有机玻璃罩、4-小白盒（内有硫酸）、5a-第一硅胶管、5b-第二硅胶管、6-标记口、7-电线、8-小风扇（市场上购置任一种）、9-采气口、10-植物、11-浇水口、12-培养盆。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例所述的实验为测定中国科学院桃源农业生态试验站施肥制度长期肥料试验田不同施肥处理中甲烷氧化菌群落结构差异。
实施例1：
一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的方法，包括如下步骤：
1）培养盆装土，加去离子水，保持淹水状态，3厘米水层；
称取1kg土壤样品，装入培养盆中，培养盆尺寸为10×16cm（直径×高），土层厚度约13cm。加去离子水，水稻栽培期间一直保持淹水状态，3厘米水层。
2）淹水一周后，在盆养盆内移栽水稻幼苗；选取长势相同的水稻幼苗，苗龄为20天，移栽至培养盆中，每个盆中移栽5株幼苗。
3）在水稻分蘖盛期时，开始标记13c-co2气体；在水稻分蘖盛期时，将水稻放入标记装置中，开始标记13c-co2气体。
4）每天标记时间段为9:00-16:00，每小时标记一次，共标记7天。
标记时，用1.5ml注射器吸取1.2ml13c-碳酸钠溶液（1m），通过罩子顶部的三通阀，注射到装有过量硫酸（2m）的塑料小白盒中，13c-碳酸钠液体立即与硫酸反应，生成大约35ml的13c-co2，顶部的小风扇可将罩子内气体混匀，以便水稻充分利用13c-co2进行光合作用。每天从上午9:00到16:00的7个小时内，即光合作用最强的7个小时内，每个小时注射一次，连续标记7天，每天从采气口采集有机玻璃罩内气体，以测定有机玻璃罩内13c-ch4丰度。利用本方法标记7天后，在缺磷处理中，有机玻璃罩内13c-甲烷气体的丰度约8%，而在氮磷钾均衡施肥处理中，玻璃罩内13c-甲烷气体的丰度达到约15%，表明了本方法可检测到不同处理间的气体样品差异，进一步表明了本方法具有可进行单盆同位素标记这一优势。
实施例2：
一种同位素原位标记土壤产甲烷古菌的装置，它由pvc管1、不锈钢方盘2、有机玻璃罩3、小白盒4（内有硫酸）、第一硅胶管5a、第二硅胶管5b、标记口6、电线7、小风扇8、采气口9、植物10、浇水口11、培养盆12组成，其连接关系是：不锈钢方盘2分别与pvc管1、有机玻璃罩3相连，不锈钢方盘2和pvc管1相连组成的底座中装有植物10，有机玻璃罩3顶端与小风扇8相连，小白盒4与小风扇8相连。在有机玻璃罩3上开有标记口6、采气口9、浇水口11，第一硅胶管5a与标记口6相连并放置于小白盒4内，第二硅胶管5b与浇水口11相连。带插头的电线7分别与小风扇和电源相连。本试验装置中的植物10为水稻，也可以用于小麦，玉米等其他植物。
有机玻璃罩3尺寸为5mm×15cm×60cm（壁厚×直径×高），在距离罩子两端各20cm处，用电钻各打一个小孔，分别插入三通阀，并在接缝处涂704胶，确保密封不透气。上部的三通阀连接一个针头，做为采气口9，用于采集罩子内气体；下部的三通阀不接针头，但是与三通阀相连的第二硅胶管5b延长，可向培养盆内浇水，做为浇水口11。有机玻璃罩3罩子顶部盖上有机玻璃圆板，并在标记开始前用704胶将圆板与有机玻璃罩3罩子密封好，有机玻璃圆板尺寸为5mm×15cm（厚度×直径），在圆板的两侧各打一个小孔，一个插入三通阀，三通阀下端连接第一硅胶管5a；另一个小孔用于将小风扇8的电线扯出。圆板上用有机玻璃胶粘贴四个圆形小帽，圆形小帽中间孔的大小以能拧紧进螺丝钉为宜。晾干后，将小风扇8用长螺丝钉固定在圆板上，小风扇8的电线从顶部圆板上的小孔中出来，并将接缝处用704胶密封好，小风扇8的尺寸为8cm×8cm×2.5cm（长×宽×厚度）。小风扇8下方用铁丝固定一个塑料小白盒4，小白盒4尺寸为6.6cm×9.5cm×6.8cm（底部直径×顶部直径×高），小白盒4中注入硫酸（浓度为2m），标记时，从罩子顶部的三通阀注射13c-碳酸钠液体，碳酸钠液体流进小白盒4中，反应生成13c-co2。
不锈钢方盘2和pvc管1相连组成一个底座。不锈钢方盘2尺寸为18cm×18cm×3cm（长×宽×高），底部用pvc管1支撑，pvc管1尺寸为16×20cm（直径×高），不锈钢方盘2和pvc管1接触区域用704胶密封好。不锈钢方盘2中间挖成一个圆形（直径10厘米），将培养盆12放入圆形中，接触区域用704胶密封好，晾干后，在不锈钢方盆2中加入去离子水，水层二厘米左右。标记时，将有机玻璃罩3罩在不锈钢底座上，通过水封形成一个密闭的系统。
利用本装置进行13c同位素标记后，水稻植株中13c同位素丰度（13c与总碳的比值）显著增加，在根茎叶中分别为10%，27%，18%，而且土壤中13c丰度也增加至2%。表明本装置对植物和土壤微生物的13c同位素标记效果好。