一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒。

背景技术：

尿酸(2,4,6-三羟基嘌呤,简称UA)分子式为C₅H₄N₄O₃，其分子量MW＝168.11。它是一种白色结晶性物质，较难溶于水、难溶于酸，也难溶于醚和乙醇，具有弱碱性，可以与强酸成盐。尿酸在生物体内以盐的形式存在，因而溶解度较高。尿酸是人体内在的嘌呤代谢终产物，大部分随尿液排出体外，少部分通过粪便和汗液排出。血浆尿酸正常值：男：149～416μmol/L，女：89～357μmol/L。当人体内嘌呤代谢紊乱，血浆中尿酸浓度过高称为高尿酸血症(HUA)。尿酸的溶解度低，在血管壁沉积易诱发痛风、继发性高血压、脑梗死、糖尿病、充血性心力衰竭、输尿管结石和肾脏疾病等，严重时造成肾衰，甚至危及生命。

血中尿酸全部从肾小球滤过，其中98％在近端肾小管起始部重吸收，然后50％在近端肾小管中部又被分泌到肾小管腔内，在近端肾小管末部又有40％～44％被重吸收，只有6％～10％的尿酸排出。正常人体内尿酸的生成与排泄较恒定，体液内尿酸含量变化，可以充分反映出人体内代谢、免疫等机能的状况。因此临床检测血清尿酸浓度对实验诊断痛风和肾脏等疾病具有重要的参考价值。

目前实验室检测尿酸出现了一种化学发光检测方法，如中国专利申请CN1912599公开的一种血清中尿酸的化学发光测定方法，其特征是，尿酸在尿酸酶催化下被氧化，生成H₂O₂，在过氧化氢酶作用下，使H₂O₂生成水和单氧，单氧可以使发光底物(一般为鲁米诺)氧化，发出光信号，光信号的大小与血清尿酸的浓度呈正相关。用已知浓度的血清尿酸与测出的发光信号，作出剂量-反应曲线，从而根据该曲线推算出待测样品中的尿酸含量。但是该方法是以鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物作为发光底物，其一般需添加过氧化物酶等催化剂，这些试剂组分的稳定性较差，而且过氧化物酶的特异性不高，由于过氧化氢在该反应中是作为主要的中间产物，因而在测定过程中容易受到干扰。

其次，目前在检测尿酸过程中最不能忽视的就是样本中存在的内源性物质如血红蛋白、胆红素及来源于临床药物应用的外源性物质，如抗坏血酸对反应造成的干扰，导致所测结果与真实值存在一定的差异。

因此，针对上述技术问题，有必要提供一种质量稳定，且能有效抗干扰，准确度高的用于检测血液中尿酸的试剂盒。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒，该试剂盒利用尿酸酶催化尿酸氧化成尿囊素和过氧化氢，过氧化氢直接与发光底物反应形成一种持续性的高强度化学信号(无需过氧化物酶)，通过过氧化氢与底物产生的光信号计算待测物含量，同时，其抗干扰能力强，准确度高，更适合临床使用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，所述试剂R1包含以下组分及浓度：

所述试剂R2包含以下组分及浓度：

所述试剂R3的组分为：

发光底物：Lumigen HyPerBlu。

进一步地，所述试剂R1中缓冲液pH为6.5-8.5，其选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R1中缓冲液pH为6.5-8.5，其为磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述试剂R1抗干扰剂Ⅰ选自抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、铁氰化钾、胆红素氧化酶和过氧化氢酶中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R1抗干扰剂Ⅰ为抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶。

进一步地，所述试剂R1和R2中所述稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乙二胺四乙酸二钠和甘油中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R1和R2中所述稳定剂为牛血清白蛋白和海藻糖。

进一步地，所述试剂R2中的缓冲液pH为8.0-10，其选自硼酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris缓冲液和磷酸盐缓冲液中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R2中的缓冲液pH为8.0-10，其为硼酸盐缓冲液。

进一步地，所述试剂R2中所述增强剂为吐温80初级降解物。

进一步地，所述吐温80初级降解物由以下步骤制得：

往100ml摇瓶内加入吐温80溶液，接种1～3wt％浓度为800～1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为30～40℃，转速为120r/min，培养8～12h，离心，取上清；依次对上清进行微滤、阳离子交换和灭菌，制得吐温80初级降解物。

进一步地，所述试剂R1和R2中所述防腐剂选自叠氮钠、proclin 300和KY100生物防腐剂中的一种或几种。

进一步地，所述试剂R1所述防腐剂为KY100生物防腐剂，试剂R2所述防腐剂为叠氮钠。

本发明提供了一种不同以往的尿酸检测试剂盒，其检测原理为：尿酸在尿酸酶的作用下，生成过氧化氢，过氧化氢与发光底物直接反应形成一种持续稳定的化学信号，通过检测发光强度，与标准曲线对比，即可推算出样品中尿酸的含量。本发明能够取得上述效果关键点在于，该发光底物可直接与过氧化氢反应，在碱性环境下即可发光。其与以往的酶比色法和化学发光法相比，最主要的区别在于，不含过氧化物酶，即不存在过氧化氢氧化反应，过氧化氢在检测反应过程中不作为中间产物，直接检测过氧化氢的浓度而非依赖酶促反应，因而检测过程中受到的干扰可以大为减少。

本发明另外一个关键点在于，本发明通过在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶作为抗干扰试剂Ⅰ，在试剂R2中加入吐温80初级降解物作为增强剂，其能够显著增强试剂盒的抗干扰能力，从而有效地去除血清中抗坏血酸、胆红素、丙酮酸、甘油三酯和血红蛋白物质的干扰，提高了检测试剂盒的准确度，比常规的酶法灵敏度和准确度更高。

需要强调的是，发明人最初的思路是将吐温80作为增强剂，但是由于本发明试剂R1和R2均是碱性溶液，吐温80在碱性条件下容易水解，由此，将吐温80作为增强剂理论上是不可行的。而发明人意外地发现，以吐温80为唯一的碳源，接种绿色木霉培养，收获上清制得的吐温80初级降解物，作为增强剂能够与抗干扰试剂Ⅰ取得较好的协同效果。并且，发明人还发现，加入了吐温80初级降解物，其还能够克服作为稳定剂的BSA在碱性环境下容易不稳定的问题，其对BSA具有一定程度上的稳定作用。

本发明具有以下优点：

1)本发明提供了一种检测血液中尿酸含量的试剂盒，其不含有过氧化物酶，不依赖酶促反应，而是通过检测过氧化物的浓度，因此检测过程中受到的干扰可以大为减少，使得本发明具有更高的灵敏度、准确度和更好的重复性。

2)本发明在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶作为抗干扰试剂Ⅰ，在试剂R2中加入吐温80初级降解物作为增强剂，其能够显著增强试剂盒对干扰物的抗干扰能力，从而有效地去除血清中抗坏血酸、胆红素、丙酮酸、甘油三酯和血红蛋白物质的干扰，且不会受到样本或试剂中色原的影响，使得结果更为准确。

附图说明

图1为标准曲线图，其中X轴表示UV浓度的log值，Y轴表示发光强度的log值；

图2为本发明实施例2试剂与北京九强的尿酸测定试剂盒的相关性对比图，其中X轴表示本发明实施例2试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是北京九强试剂盒测定的血清结果。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本发明发光底物Lumigen HyPerBlu购自美国Lumigen Inc。

实施例1、吐温80初级降解物的制备

往100ml摇瓶内加入吐温80溶液，接种1～3wt％浓度为1000cfu/mL的绿色木霉，设置温度为35℃，转速为120r/min，培养12h，离心，取上清；依次对上清进行微滤、732型阳离子交换树脂进行阳离子交换和灭菌，制得吐温80初级降解物。

实施例2、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

试剂R1：

试剂R2：

试剂R3：

Lumigen HyPerBlu。

实施例3、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

实施例3与实施例2的区别在于，试剂R1中抗干扰剂Ⅰ为抗坏血酸氧化酶和亚铁氰化钾，吐温80初级降解物的浓度为0.03w/v％，其余参数及操作如实施例2所示。

实施例4、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

实施例4与实施例2的区别在于，试剂R1中抗干扰剂Ⅰ为胆红素氧化酶和亚铁氰化钾，吐温80初级降解物的浓度为1w/v％，其余参数及操作如实施例2所示。

实施例5、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

实施例5与实施例2区别在于，所述试剂R1中缓冲液为Tris缓冲液，R2中缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，其余参数及操作如实施例2所示。

对比例1、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

对比例1与实施例2区别在于，不含有增强剂，其余参数及操作如实施例2所示。

对比例2、一种酶化学发光法测定尿酸的检测试剂盒

对比例2与实施例2区别在于，增强剂加入试剂R1中，其余参数及操作如实施例2所示。

实施例6、检测方法

本发明实施例2～5所述的尿酸检测试剂盒，适用于多种类型的全自动或半自动发光分析仪，以科斯迈SMART1000全自动发光仪为例，其参数如表1。

分析方法：一点终点法，即加入90μL试剂R1和5μL样本于37℃孵育5min，加入90μL试剂R2，37℃孵育5min，加入30μL发光底物R3，反应5min后检测发光值RLU，通过仪器计算得到最终检测结果。测定后以标准品的UA浓度的log值作为X坐标，发光强度RLU的log值作为Y坐标，作出标准曲线如图1所示，方程Y＝1.0002X-0.3015，R²＝1，根据该标准曲线计算出样品中尿酸的浓度。

表1

试验例一、相关性试验

使用本发明试剂(具体配方同实施例2)和北京九强的尿酸测定试剂盒，分别采用科斯迈SMART1000全自动发光仪、库贝尔iMagic-M7全自动生化分析仪对40份新鲜人血清按各自的参数同时进行测定，对测定值进行相关性回归分析，测定结果见图2。

由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R²＝0.9996，回归方程y＝1.0046x-1.7609。结果表明本试剂与已上市对比试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

试验例二、准确度和精密度试验

试剂：本发明试剂(具体配方同实施例2)、标准品、质控品。

仪器：科斯迈SMART1000全自动发光仪。

操作步骤：使用标准品定标，测定各质控10次，计算测试均值、SD、CV和相对偏差。

表2结果显示，本发明试剂检测各质控的相对偏差均小于3％，准确度非常好。测定10次同个样本的CV值均小于2％，精密度较好。

表2测试结果(μmol/L)

试验例三、线性试验

采用本发明试剂(具体配方同实施例2)、标准品、高浓度尿酸样品、质控品。

仪器：科斯迈SMART1000全自动发光仪。

操作步骤：以空白溶液作为稀释液，按5:1、5:2、5:3、5:4、5:5(原倍)稀释，各样本重复测定3次。

表3结果表示，本发明试剂在0～2000μmol/L范围内线性良好，线性范围很宽。

表3试验结果(μmol/L)

试验例四、抗干扰试验

取新鲜混合血清，分成5等份，然后将每等份再分成10等份，按照下表4浓度加入不同的干扰物质，取本发明实施例2～4以及对比例1～2试剂盒，分别测定血清中尿酸的含量，测定结果如表5所示。

相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物样本的测定均值)/空无干扰物样本的测定均值×100％。

表4干扰物质浓度

表5检测结果

由表5可知，本发明实施例2～4所述试剂盒抗干扰能力强，其能显著减小抗坏血酸、胆红素、丙酮酸、甘油三酯和血红蛋白对试剂盒检测的影响，具有优异的抗干扰能力。而与实施例2相比，对比例1试剂盒(去掉了增强剂)，其对抗坏血酸和胆红素的抗干扰能力无明显下降，但是对丙酮酸、甘油三酯和血红蛋白干扰物的抗干扰能力显著下降，检测结果表明存在的负干扰更大；对比例2试剂盒中增强剂在R1中加入制备得到的试剂盒的抗干扰能力与实施例2相比也有明显地下降。这说明，与现有技术中相比，本发明试剂盒具有更优异的抗干扰能力，从而具有更高的准确度和灵敏度。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。