本发明属于兽药残留检测
技术领域：
，尤其涉及一种未使用离子对试剂测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法。
背景技术：
：氨基糖苷类抗生素是一类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有显著的抑杀作用，广泛应用于治疗各种动物性疾病，也常添加到饲料中，用于促进动物生长发育。然而，此类药物具有耳毒性、肾毒性等副作用，持续用药以及不合理使用会导致氨基糖苷类药物在食用动物中过量残留，通过食物链对人类造成潜在的危害。目前国内外报道关于动物源性食品中氨基糖苷类药物的检测方法，主要有液相色谱-串联谱法等，但是由于氨基糖苷类药物具有高的极性，很难在传统的反相色谱柱上保留，因此需要在流动相中添加离子对试剂，以增强色谱保留。但离子对试剂的使用不但会对色谱柱造成不可逆的损害，而且还会产生严重的离子抑制以及腐蚀离子源。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种未使用离子对试剂测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法，在不使用离子对试剂的条件下，同样能够增强色谱保留，能够检测动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的含量。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种未使用离子对试剂测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法，包括：将进样样品进行液相色谱-串联质谱检测，根据氨基糖苷类药物含量的标准曲线与进样样品的液相色谱图，得到进样样品中氨基糖苷类药物的含量；所述液相色谱的色谱柱为sielcobeliscr；所述液相色谱的流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为乙腈，所述流动相b为甲酸溶液或乙酸溶液；所述甲酸溶液的体积百分含量为0.5～1.5％，所述乙酸溶液的体积百分含量为1.5～2.5％；所述液相色谱的梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相a的体积含量为流动相体积的85％；0.5～3.8min，流动相a的体积含量由85％降低至65％；3.8～4.3min，流动相a的体积含量由65％降低至55％；4.3～4.5min，流动相a的体积含量为55％；4.5～6.5min，流动相a的体积含量由55％降低至0％；6.5～11min，流动相a的体积含量为0％；11～12min，流动相a的体积含量由0％增加至85％；12～21min，流动相a的体积含量为85％。优选的，所述液相色谱的条件包括：所述流动相的流速为0.4～0.8ml/min；所述液相色谱的柱温为25～40℃；所述液相色谱的进样体积为5～20μl。优选的，所述串联质谱的条件包括：所述串联质谱的离子源为电喷雾电离离子源；所述串联质谱的电喷雾电压为4000～5500v；所述串联质谱的离子源温度为450～650℃；所述串联质谱的气帘气压力为20～35psi；所述串联质谱的雾化气压力为45～65psi；所述串联质谱的辅助气压力为45～65psi；所述串联质谱的滞留时间为20～100s。优选的，所述氨基糖苷类药物包括新霉素b、安普霉素、卡那霉素b、妥布霉素、威他霉素、潮霉素b、庆大霉素、阿米卡星和大观霉素中的一种或几种。优选的，所述进样样品的制备方法包括：1)将动物肌肉组织与磷酸盐提取液混合，进行第一超声处理8～12min，得到第一超声处理物，将所述第一超声处理物离心分离后，得到第一沉淀和第一清液；2)将所述步骤1)得到的第一沉淀与磷酸盐提取液混合，进行第二超声处理8～12min，得到第二超声处理物，将所述第二超声处理物离心分离后，得到第二沉淀和第二清液；3)将所述步骤1)得到的第一清液与所述步骤2)得到的第二清液混合，得到混合清液；4)将所述步骤3)得到的混合清液加入mcx柱中，依次用乙酸溶液和水淋洗，再用氨甲醇溶液进行洗脱，得到洗脱液；5)将所述步骤4)得到的洗脱液经氮气吹干，得到干燥物，将所述干燥物与乙酸溶液混合，得到第三混合物，将所述第三混合物过滤后，得到的液相组分作为进样样品。优选的，所述磷酸盐提取液每1l包括：磷酸二氢钾1.0～2.0g，乙二胺四乙酸二钠0.1～0.2g，三氯乙酸10～50g。优选的，所述步骤1)动物肌肉组织的质量与磷酸盐提取液的体积比为(1～3)g:(4～6)ml。优选的，所述步骤1)和步骤2)离心分离的条件独立的包括：所述离心分离的转速为8000～10000rpm，所述离心分离的时间为8～12min。优选的，所述步骤5)乙酸溶液的体积百分含量为1～4％。优选的，所述步骤4)氨甲醇溶液中氨气的体积百分含量优选为15～25％。本发明提供了一种测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法，在不使用离子对试剂的条件下，同样能够增强色谱保留，能够检测动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的含量。本发明实施例的结果显示：在不使用离子对试剂的条件下，同样能够增强色谱保留，能够检测动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的含量，药物的检测限和定量限分别在1～10μg/kg和2～20μg/kg范围内，表明该方法具有很高的灵敏度，能定量准确测定动物组织中痕量水平的抗菌药物残留；批内和批间精密度分别在2～14.4％和3.7～19.8％之间，表明具有较好的准确度和精密度。附图说明图1为空白鸡肉样品的srm色谱图；图2为空白鸡肉样品中添加10种氨基糖苷类药物的混合标准溶液(50μg/kg)的srm色谱；图3为空白牛肉样品的srm色谱图；图4为空白牛肉样品中添加10种氨基糖苷类药物的混合标准溶液(50μg/kg)的srm色谱；图5为空白猪肉样品的srm色谱图；图6为空白猪肉样品中添加10种氨基糖苷类药物的混合标准溶液(50μg/kg)的srm色谱。具体实施方式本发明提供了一种未使用离子对试剂测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法，包括：将进样样品进行液相色谱-串联质谱检测，根据氨基糖苷类药物含量的标准曲线与进样样品的液相色谱图和质谱图，得到进样样品中氨基糖苷类药物的含量；所述液相色谱的色谱柱为sielcobeliscr；所述液相色谱的流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为乙腈，所述流动相b为甲酸溶液或乙酸溶液；所述甲酸溶液的体积百分含量为0.5～1.5％，所述乙酸溶液的体积百分含量为1.5～2.5％；所述液相色谱的梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相a的体积含量为流动相体积的85％；0.5～3.8min，流动相a的体积含量由85％降低至65％；3.8～4.3min，流动相a的体积含量由65％降低至55％；4.3～4.5min，流动相a的体积含量为55％；4.5～6.5min，流动相a的体积含量由55％降低至0％；6.5～11min，流动相a的体积含量为0％；11～12min，流动相a的体积含量由0％增加至85％；12～21min，流动相a的体积含量为85％。在本发明中，所述液相色谱的色谱柱为sielcobeliscr。在本发明中，所述色谱柱sielcobeliscr的规格优选为5μm，150mm×2.1mmi.d.。在本发明中，所述色谱柱sielcobeliscr同时具有反相、离子交换和亲水作用。在本发明中，所述氨基糖苷类药物优选包括新霉素b、安普霉素、卡那霉素b、妥布霉素、威他霉素、潮霉素b、庆大霉素、阿米卡星和大观霉素中的一种或几种。在本发明中，所述动物肌肉组织优选来自于猪肉、牛肉、鸡肉、羊肉或鱼肉。在本发明中，所述动物肌肉组织优选绞碎后再提供，本发明对所述动物肌肉组织绞碎的程度没有特殊限定，采用本领域技术人员常规绞碎程度即可。在本发明中，所述液相色谱的条件包括：所述液相色谱的流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为乙腈，所述流动相b为甲酸溶液或乙酸溶液；所述流动相的流速为0.4～0.8ml/min；所述液相色谱的柱温为25～40℃；所述液相色谱的进样体积为5～20μl；所述液相色谱的梯度洗脱程序：0～0.5min，流动相a的体积含量为流动相体积的85％；0.5～3.8min，流动相a的体积含量由85％降低至65％；3.8～4.3min，流动相a的体积含量由65％降低至55％；4.3～4.5min，流动相a的体积含量为55％；4.5～6.5min，流动相a的体积含量由55％降低至0％；6.5～11min，流动相a的体积含量为0％；11～12min，流动相a的体积含量由0％增加至85％；12～21min，流动相a的体积含量为85％。在本发明中，所述液相色谱的流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a优选为乙腈，所述流动相b优选为甲酸溶液或乙酸溶液。在本发明中，所述甲酸溶液的体积百分含量优选为0.5～1.5％，更优选为0.8～1.2％，最优选为1.0％；所述乙酸溶液的体积百分含量优选为1.5～2.5％，更优选为1.8～2.2％，最优选为2.0％。在本发明中，所述流动相的流速优选为0.5～0.7ml/min，更优选为0.6ml/min。在本发明中，所述液相色谱的柱温优选为25～40℃，更优选为30～35℃，最优选为32℃。在本发明中，所述液相色谱的进样体积优选为5～20μl，更优选为10～15μl，更优选为12μl。在本发明中，所述液相色谱的梯度洗脱程序优选为：0～0.5min，流动相a的体积含量为流动相体积的85％；0.5～3.8min，流动相a的体积含量由85％降低至65％；3.8～4.3min，流动相a的体积含量由65％降低至55％；4.3～4.5min，流动相a的体积含量为55％；4.5～6.5min，流动相a的体积含量由55％降低至0％；6.5～11min，流动相a的体积含量为0％；11～12min，流动相a的体积含量由0％增加至85％；12～21min，流动相a的体积含量为85％。在本发明中，所述串联质谱的质谱条件包括：所述串联质谱的离子源为电喷雾电离离子源；所述串联质谱的电喷雾电压为4000～5500v；所述串联质谱的离子源温度为450～650℃；所述串联质谱的气帘气压力为20～35psi；所述串联质谱的雾化气压力为45～65psi；所述串联质谱的辅助气压力为45～65psi；所述串联质谱的滞留时间为20～100s。在本发明中，所述串联质谱的离子源优选为电喷雾电离离子源。在本发明中，所述串联质谱的电喷雾电压优选为4000～5500v，更优选为4500～5200v，最优选为4800～5000v。在本发明中，所述串联质谱的离子源温度优选为450～650℃，更优选为500～600℃，最优选为520～580℃。在本发明中，所述串联质谱的气帘气压力优选为20～35psi，更优选为25～30psi，最优选为25psi。在本发明中，所述串联质谱的雾化气压力优选为45～65psi，更优选为50～60psi，更优选为55～58psi。在本发明中，所述串联质谱的辅助气压力优选为45～65psi，更优选为50～60psi，更优选为55～58psi。在本发明中，所述串联质谱的滞留时间优选为20～100s，最优选为30～90s，最优选为40～80s。在本发明中，所述所述进样样品的制备方法包括：1)将动物肌肉组织与磷酸盐提取液混合，进行第一超声处理8～12min，得到第一超声处理物，将所述第一超声处理物离心分离后，得到第一沉淀和第一清液；2)将所述步骤1)得到的第一沉淀与磷酸盐提取液混合，进行第二超声处理8～12min，得到第二超声处理物，将所述第二超声处理物离心分离后，得到第二沉淀和第二清液；3)将所述步骤1)得到的第一清液与所述步骤2)得到的第二清液混合，得到混合清液；4)将所述步骤3)得到的混合清液加入mcx柱中，依次用乙酸溶液和水淋洗，再用氨甲醇溶液进行洗脱，得到洗脱液；5)将所述步骤4)得到的洗脱液经氮气吹干，得到干燥物，将所述干燥物与乙酸溶液混合，得到第三混合物，将所述第三混合物过滤后，得到的液相组分为进样样品。本发明将动物肌肉组织与磷酸盐提取液混合，进行第一超声处理8～12nin，得到第一超声处理物，将所述第一超声处理物离心分离后，得到第一沉淀和第一清液。在本发明中，所述动物肌肉组织的质量与与磷酸盐提取液的体积比优选为(1～3)g:(4～6)ml，更优选为(1.5～2.5)g:(4.5～5.5)ml，更优选为3g:5ml。在本发明中，所述第一超声处理的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。本发明对所述超声处理的其它条件如超声功率等没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的条件即可。在本发明中，所述第一离心分离的条件优选包括：所述离心分离的转速优选为8000～10000rpm，更优选为8500～9500rpm，最优选为9000rpm；所述离心分离的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。在本发明中，所述磷酸盐提取液每1l优选包括：磷酸二氢钾1.0～2.0g，乙二胺四乙酸二钠0.1～0.2g，三氯乙酸10～50g，更优选包括磷酸二氢钾1.2～1.5g，乙二胺四乙酸二钠0.12～0.18g，三氯乙酸15～30g，最优选包括磷酸二氢钾1.36g，乙二胺四乙酸二钠0.15g，三氯乙酸20g。在本发明的实施例中，所述磷酸盐提取液的制备方法优选为将磷酸二氢钾用980ml水溶解，再依次加入乙二胺四乙酸二钠和三氯乙酸，充分溶解混匀，用超纯水定容至1l。本发明将得到的第一沉淀与磷酸盐提取液混合，进行第二超声处理8～12min，得到第二超声处理物，将所述第二超声处理物离心分离后，得到第二沉淀和第二清液。在本发明中，所述第二混合物中，第一沉淀的质量以动物肌肉组织的质量计算，磷酸盐提取液的体积与动物肌肉组织的质量与比优选为(4～6)ml:(1～3)g，更优选为(4.5～5.5)ml:(1.5～2.5)g，更优选为5ml:3g。在本发明中，所述第二超声处理的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。本发明对所述超声处理的其它条件如超声功率等没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的条件即可。在本发明中，所述第二离心分离的条件优选包括：所述离心分离的转速优选为8000～10000rpm，更优选为8500～9500rpm，最优选为9000rpm；所述离心分离的时间优选为8～12min，更优选为9～11min，最优选为10min。本发明将所述步骤1)得到的第一清液与所述步骤2)得到的第二清液混合，得到混合清液。本发明对所述混合采用的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员常规的混合方式即可。在本发明中，所述混合清液优选经氨水调节ph值后再加入mcx柱中，所述ph值优选为5.0～6.0，更优选为5.2～5.8，最优选为5.5。本发明将所述步骤3)得到的混合清液加入mcx柱中，依次用乙酸溶液和水淋洗，再用氨甲醇溶液进行洗脱，得到洗脱液。在本发明中，所述mcx柱优选经过醇和酸溶液活化后再使用，所述酸溶液的体积百分含量优选为1～3％，更优选为1.5～2.5％，最优选为2％；所述醇优选为甲醇或乙醇，所述酸溶液优选为甲酸溶液或乙酸溶液。在本发明中，所述醇与混合清液的体积比优选为(2～4):(96～98)ml，更优选为(2.5～3.5):(96.5～97.5)，最优选为3:97；所述酸溶液与混合清液的体积比优选为(2～4):(96～98)，更优选为(2.5～3.5):(96.5～97.5)，最优选为3:97。在本发明中，所述mcx柱具有疏水相互作用和强离子交换作用。本发明将所述混合清液加入mcx柱中，依次用乙酸溶液和水淋洗，所述乙酸溶液与混合清液的体积比优选为(2～4)(96～98)，更优选为(2.5～3.5):(96.5～97.5)，最优选为3:97；所述水与混合清液的体积比优选为(2～4):(96～98)，更优选为(2.5～3.5):(96.5～97.5)，最优选为3:97。在本发明中，所述乙酸溶液的体积百分含量优选为1～3％，更优选为1.5～2.5％，最优选为2％。在本发明中，所述氨甲醇溶液中氨气的体积百分含量优选为15～25％，更优选为18～22％，最优选为20％。在本发明中，所述氨甲醇溶液与乙酸溶液的体积比优选为(4～6):(2～4)，更优选为(4.5～5.5):(2.5～3.5)，最优选为5:3。在本发明中，所述mcx柱的洗脱剂的流速优选为0.5～1.5ml/min，更优选为0.8～1.2ml/min，最优选为1ml/min。本发明将所述步骤4)得到的洗脱液经氮气吹干，得到干燥物，将所述干燥物与乙酸溶液混合，得到第三混合物，将所述第三混合物过滤后，得到的液相组分作为进样样品。在本发明中，所述乙酸溶液的体积与干燥物的质量比优选为(1～4)ml:(40～160)mg，更优选为(1.5～3.5)ml:(60～140)mg，最优选为3ml:80mg。在本发明中，所述乙酸溶液的体积百分含量优选为1～3％，更优选为1.5～2.5％，最优选为2％。本发明将第三混合物过滤后，得到待测样品，所述过滤优选采用0.22μm滤膜进行过滤。本发明将进样样品进行液相色谱-串联质谱检测，根据氨基糖苷类药物含量的标准曲线与进样样品的液相色谱图，得到进样样品中氨基糖苷类药物的含量。本发明中，所述氨基糖苷类药物的标准溶液的配制优选为：将所述氨基糖苷类药物10mg用超纯水定容于10ml棕色容量瓶中，混匀，得到浓度为1mg/ml的标准储备溶液，并根据需要用超纯水稀释成适当质量浓度的混合标准工作液。在本发明中，所述氨基糖苷类药物含量的标准曲线的制备方法优选包括：将2g空白样品按照上述技术方案所述的方法得到进样样品，将标准储备溶液用进样样品配制成浓度分别为5、10、20、50、100、200、400、500μg/l的标准工作液，上机检测。以目标物在空白基质样品中的浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，绘制氨基糖苷类药物含量的标准曲线。本发明优选在空白动物肌肉组织中添加目标分析物，按照上述技术方案所述的方法得到进样样品进行试验，分别以信噪比(s/n)高于3和10时所对应的样品添加浓度为检测限和定量限。在本发明中，当所述氨基糖苷类药物优选为新霉素b、安普霉素、卡那霉素b、妥布霉素、威他霉素、潮霉素b、庆大霉素、阿米卡星或大观霉素时，所述动物肌肉组织优选为鸡肉、牛肉或猪肉时，所述氨基糖苷类药物含量的标准曲线、线性范围及相关系数如表1所示。表1药物基质匹配标准曲线、线性范围及相关系数(n＝5)下面结合实施例对本发明提供的一种未使用离子对试剂测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1本实施例中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为体积百分浓度。1.标准溶液的配制精密称取新霉素b、安普霉素、卡那霉素b、妥布霉素、威他霉素、潮霉素b、庆大霉素、阿米卡星、大观霉素各10mg，用超纯水定容于10ml棕色容量瓶中，混匀，得到各药物浓度为1mg/ml的标准储备溶液，并根据需要用超纯水稀释成适当质量浓度的混合标准工作液，-20℃避光保存，有效期1个月。2.磷酸盐提取液的配制准确称取磷酸二氢钾1.36g，用980ml水溶解，依次加入乙二胺四乙酸二钠0.15g和三氯乙酸20g，充分溶解混匀，用超纯水定容至1l。3.样品的制备称量2g动物肌肉组织于50ml聚丙烯离心管中，加入5ml磷酸盐提取液，超声提取10min后，9000rpm离心10min，得到第一沉淀和第一清液，将第一沉淀用5ml磷酸盐提取液超声提取10min后，9000rpm离心10min，得到第二沉淀和第二清液，将第一清液和第二清液合并，得到混合清液。将混合清液用氨水调节ph值为到5.5，得到调节ph值后的混合清液。将调节ph值后的混合清液加至已经用3ml甲醇和3ml2％乙酸水活化的mcx小柱，控制流速为1ml/min；依次用3ml乙酸水溶液和3ml水淋洗；最后用5ml20％氨甲醇(体积百分含量)洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干，得到干燥物，干燥物用4ml2％乙酸水溶液溶解，得到第三混合物，第三混合物经0.22μm滤膜过滤，除去不溶性杂质后，得到待测样品，待测样品供液相色谱-串联质谱仪检测。4.色谱条件色谱柱：sielcobeliscr，5μm，150mm×2.1mmi.d.；流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a为乙腈，流动相b为1％甲酸溶液；流速：0.6ml/min；柱温：40℃；进样体积：5μl，药物的梯度洗脱程序见表2。表2药物的梯度洗脱程序时间(min)乙腈(％)1％甲酸(％)流速(ml/min)085150.60.585150.63.865350.64.355450.64.555450.66.501000.61101000.61285150.62185150.65.质谱条件离子源：电喷雾电离离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；气帘气压力：20psi；雾化气压力：55psi；辅助气压力：60psi。氨基糖苷类药物的保留时间和优化质谱条件见表3。表3氨基糖苷类药物的质谱参数6.标准曲线、检测限和定量限准确称取2g空白样品于50ml聚丙烯离心管中，按照上述样品提取与净化后，得到基质提取液。将标准贮备液用基质提取液配制成不同浓度水平(5、10、20、50、100、200、400、500μg/l)的标准工作液，上机检测。以目标物在空白基质样品中的浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准曲线，结果见表4。表4药物基质匹配标准曲线、线性范围及相关系数(n＝5)在空白肌肉样品中添加目标分析物，按照上述样品前处理方法进行试验，分别以信噪比(s/n)高于3和10时所对应的样品添加浓度为检测限和定量限。从表3中可知在试验浓度范围内各分析物的基质匹配标准曲线线性良好，相关系数均大于0.99。所有药物的检测限和定量限分别在1～10μg/kg和2～20μg/kg范围内，表明该方法具有很高的灵敏度，能定量准确测定动物组织中痕量水平的抗菌药物残留。7.回收率与精密度空白样品中添加三个不同浓度水平(25、50和100μg/kg)的氨基糖苷类药物的混合标准溶液，经上述所述的提取和净化步骤后，各浓度添加水平的回收率和精密度见表5。表5回收率与精密度从表4可知，在25、50和100μg/kg三个浓度添加水平下，除新霉素的平均回收率相对较低外(大于60％)，其他药物的平均回收率均高于65％，批内和批间精密度分别在2～14.4％和3.7～19.8％之间。表明本申请提供的方法具有较好的准确度和精密度，能够满足动物组织样品中兽药残留检测分析的要求。由以上实施例可知，本发明提供了一种测定动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的方法，在不使用离子对试剂的条件下，同样能够增强色谱保留，能够检测动物肌肉组织中氨基糖苷类药物的含量，具有较好的准确度和精密度，能够满足动物组织样品中兽药残留检测分析的要求。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12