一种凝血酶检测方法及其试剂盒与流程

本申请涉及一种凝血酶检测方法及其试剂盒，属于化学与生物传感技术领域。

背景技术

凝血酶(thrombin)作为一种止血药，能催化纤维蛋白元变成纤维蛋白来促使血液凝固，常用于毛细血管出血的局部止血以及外科手术后组织愈合。凝血酶的缺失或产生机制病变将会导致多种出血性疾病，如脑出血，消化道出血等，严重的还会引发癌症，因此凝血酶也经常用作诊断相关疾病的生物标志物。目前检测凝血酶的方法主要有电化学方法，纳米金显色法，表面增强拉曼法(sers),荧光信号检测法等，但均存在一定的缺点，如适用范围上各自不同，并且需要借助大型的检测仪器或者合成需要信号标记的探针等，大大提高了检测成本，降低了检测效率。因此，开发一种低廉，快速，灵敏，方便的凝血酶检测方法对于疾病的临床诊断、治疗监测以及预后评估具有重要的应用价值。

肽核酸(peptidenucleicacids,pna)是一种人工合成的脱氧核糖核酸(dna)类似物，因其极高的生物稳定性以及其对核酸结合的高度特异性和亲和力，在分子生物学应用和疾病诊断领域中显示出了广阔的前景。pna、dna和rna的主要区别在于主链的结构差异，dna和rna的主链由磷酸酯键相连的(脱氧)核糖组成，pna的主链则由n-2-(氨乙基)-甘氨酸结构单元构成，不同结构单元间由类似肽键的酰胺键相连。这种结构上的改变使pna与其天然类似物dna间产生了许多重要的性质差异，并在很多不同的研究领域中引起了广泛关注。目前已有不少文献报道了基于dna的生物传感器在遗传分析、传染病检测和环境监测等领域的研究，而作为dna的人工合成类似物pna的研究才刚刚起步。因此，鉴于pna优越的物理、化学和生物学性质，pna的引入必将极大的提高并改善生物纳米技术，使其可以用于发展新一代高灵敏度、高特异性的生物传感器并用于分子诊断。

技术实现要素：

根据本申请的一个方面，提供了一种凝血酶检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)根据凝血酶适配体的dna序列合成互补的pna链；

2)将凝血酶适配体的dna与所述步骤1)中合成的pna链混合，配制成底物溶液；

3)向所述底物溶液中加入显色剂，获得第一光谱信息；

4)加入待测样品，获得第二光谱信息，对比所述第一光谱信息与所述第二光谱信息，得到所述待测样品中的凝血酶浓度。

适配体(aptamer)是一种单链dna或rna，不但能与互补的核酸链特异性结合，还能与目标物结合同时发生结构的变化，如凝血酶适配体能识别凝血酶并在与之结合的同时形成g四链体。因此根据亲和性不同，当适配体dna与pna特异性结合成双链后，凝血酶能够竞争性结合适配体dna，从而破坏pna/dna双链结构。青色素染料disc2(5)能够聚集在pna/dna双链的螺旋结构中，使溶液呈现紫红色，当凝血酶与适配体dna竞争性结合后，pna/dna双链结构被破坏，染料disc2(5)的聚集状态也随之被破坏，溶液颜色从紫红色变为蓝色，该颜色变化明显并且肉眼可见。

优选地，所述第一光谱信息包括颜色、紫外可见光谱、500nm～700nm中任一波长处的吸光度中的至少一种；

所述第二光谱信息包括颜色、紫外可见光谱、500nm～700nm中任一波长处的吸光度中的至少一种；

优选地，所述第一光谱信息为所述底物溶液在波长534nm处的吸光度；

所述第二光谱信息为加入凝血酶后的溶液在波长534nm处的吸光度。

优选地，所述第一光谱信息与所述第二光谱信息的吸光度差值与所述待测样品中的凝血酶浓度成正比。

本发明首先通过底物和染料disc2(5)优化来确定最佳的检测体系，同时监测体系紫外可见吸收光谱的变化。加入不同浓度的凝血酶溶液，对溶液颜色进行紫外可见吸收光谱的检测，以达到对凝血酶的传感检测目的，检测限可以达到0.4nm。

优选地，所述步骤1)中pna链的长度为至少10个碱基。

优选地，所述步骤1)中的pna链的碱基序列为：aacctgcctc。

优选地，所述步骤2)中，所述底物溶液中凝血酶适配体dna的浓度与pna链的浓度均为1-3μm。

优选地，所述步骤2)中，底物溶液中凝血酶适配体dna的浓度与pna链的浓度均为2μm。

优选地，所述步骤3)中显色剂为青色素染料disc2(5)。

优选地，所述步骤3)中显色剂以溶液的形式加入底物溶液，加入底物溶液后，显色剂的浓度为10-50μm。

优选地，所述底物溶液与所述显色剂溶液的体积比为(3～5)：1。

优选地，将凝血酶适配体的dna与pna链混合后，加热5～15分钟，再于室温下冷却。

优选地，所述加热在80～100℃的条件下进行。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本发明通过颜色变化来作为检测信号，不需要对核酸探针进行任何修饰，也不需要复杂的检测设备，还能通过肉眼观测颜色变化。

2)本发明的方法对凝血酶的检测限低，并且特异性好。

附图说明

图1为底物溶液中加入凝血酶样品前后的紫外可见吸收光谱图。

图2为底物溶液中加入50nm凝血酶样品前后的照片。

图3为凝血酶滴定实验的曲线图。

图4为基于染料disc2(5)和核酸底物的凝血酶检测标准曲线示意图。

图5为底物溶液中加入100nm牛血清蛋白和免疫球蛋白g样品后的紫外可见吸收光谱图。

图6为分别加入凝血酶、牛血清蛋白和免疫球蛋白g样品后，溶液在534nm处的吸光度变化。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买，其中dna序列材料购自杰李生物(上海)股份有限公司。

本发明实施例中使用的所有的玻璃仪器都用碱缸浸泡24h，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2mω的milli-q超纯水。

实施例1

(1)检测用的核酸的设计与合成：未经修饰的凝血酶适配体dna序列：5’-agtccgtggtagggcaggttggggtgact-3’，无需进一步纯化即可使用；通过固相合成法手动合成10个碱基长度的互补pna链：aacctgcctc，在多肽合成管中裂解得到pna粗品后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解。样品在hplc上纯化，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，用紫外可见吸收光谱仪进行浓度定量。

(2)凝血酶检测及其检测限探究：在tris-hcl缓冲液中加入相同浓度的pna和dna(2μm)作为底物溶液，在95℃加热10分钟并置于室温缓慢冷却。用甲醇配制180μm染料溶液并依次加入到底物溶液中，使其最终浓度为30μm观察颜色变化。向底物溶液中加入凝血酶样品进行滴定实验，使溶液中的凝血酶为50nm。随着溶液中凝血酶的浓度增加，溶液从紫红色逐渐变为蓝色。

图1给出了溶液中加入凝血酶样品前后的紫外可见吸收光谱图变化，实线表示溶液中不含凝血酶样品，虚线表示溶液中加入50nm凝血酶样品。从该图中可以看出当溶液中不含凝血酶样品时，534nm处的吸收峰值为0.75左右，明显高于590nm吸收峰和651nm处的吸收峰值；加入凝血酶样品后，534nm处的吸收峰数值明显降低，其吸收值低于0.4，并且明显低于590nm处的吸收峰和651nm处的吸收峰值；加入凝血酶前后590nm处吸收峰值和651nm处的吸收峰值虽然略有下降，但并不明显。

图2显示了溶液中加入50nm凝血酶样品前后的颜色变化，溶液从紫红色变为蓝色。

实施例2

(1)检测用的核酸的设计与合成：未经修饰的凝血酶适配体dna序列：5’-agtccgtggtagggcaggttggggtgact-3’，无需进一步纯化即可使用；通过固相合成法手动合成10个碱基长度的互补pna链：aacctgcctc，在多肽合成管中裂解得到pna粗品后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解。样品在hplc上纯化，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，用紫外可见吸收光谱仪进行浓度定量。

(2)凝血酶检测及其检测限探究：在tris-hcl缓冲液中加入相同浓度的pna和dna(1.5μm)作为底物溶液，在80℃加热15分钟并置于室温缓慢冷却。用甲醇配制40μm染料溶液并依次加入到底物溶液中，使其最终浓度为10μm观察颜色变化。向底物溶液中加入凝血酶样品进行滴定实验，使溶液中的凝血酶为50nm。随着溶液中凝血酶的浓度增加，溶液从紫红色逐渐变为蓝色。

实施例3

(1)检测用的核酸的设计与合成：未经修饰的凝血酶适配体dna序列：5’-agtccgtggtagggcaggttggggtgact-3’，无需进一步纯化即可使用；通过固相合成法手动合成10个碱基长度的互补pna链：aacctgcctc，在多肽合成管中裂解得到pna粗品后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解。样品在hplc上纯化，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，用紫外可见吸收光谱仪进行浓度定量。

(2)凝血酶检测及其检测限探究：在tris-hcl缓冲液中加入相同浓度的pna和dna(2.5μm)作为底物溶液，在100℃加热5分钟并置于室温缓慢冷却。用甲醇配制250μm染料溶液并依次加入到底物溶液中，使其最终浓度为50μm观察颜色变化。向底物溶液中加入凝血酶样品进行滴定实验，使溶液中的凝血酶为50nm。随着溶液中凝血酶的浓度增加，溶液从紫红色逐渐变为蓝色。

实施例4

(1)检测用的核酸的设计与合成：未经修饰的凝血酶适配体dna序列：5’-agtccgtggtagggcaggttggggtgact-3’，无需进一步纯化即可使用；通过固相合成法手动合成10个碱基长度的互补pna链：aacctgcctc，在多肽合成管中裂解得到pna粗品后用无水乙醚清洗三次，分别离心弃上清，用氮气将样品吹干后用超纯水溶解。样品在hplc上纯化，取目标峰进行质谱鉴定，多次纯化收集目标峰产物并将产物冻干后用超纯水溶解，用紫外可见吸收光谱仪进行浓度定量。

(2)凝血酶检测及其检测限探究：在tris-hcl缓冲液中加入相同浓度的pna和dna(1.5μm)作为底物溶液，在80℃加热15分钟并置于室温缓慢冷却。用甲醇配制150μm染料溶液并依次加入到底物溶液中，使其最终浓度为30μm观察颜色变化。向底物溶液中加入凝血酶样品进行滴定实验，使溶液中的凝血酶分别为0nm、1nm、2nm、3nm、5nm、7nm、12nm、17nm、27nm、37nm。随着溶液中凝血酶的浓度增加，溶液从紫红色逐渐变为蓝色，并同时进行紫外可见吸收光谱测试，绘制凝血酶检测标准曲线。

图3是加入不同浓度凝血酶后的紫外吸收曲线，图中曲线a,b,c,d,e,f,g,h,i,j分别代表溶液中凝血酶浓度为0nm、1nm、2nm、3nm、5nm、7nm、12nm、17nm、27nm、37nm时的紫外吸光度曲线。

随着溶液中凝血酶浓度的增加，534nm处的吸收峰值逐渐降低，而590nm处的吸收峰值和651nm处的吸收峰值变化不大。

标准曲线如图4所示，图中以log[凝血酶浓度]作为x轴，以(a0-a)/a0作为y轴绘制标准曲线(其中a0为溶液中未加凝血酶样品前溶液在534nm处的吸收峰值，a为溶液中加入不同浓度凝血酶后溶液在534nm处对应的吸收峰值)，可以得到线性回归方程(y＝0.10261+0.33913x,r²＝0.9967)。可以看出溶液在534nm处的吸收峰值随着溶液中凝血酶浓度的增加而逐渐降低，并且两者具有线性相关性。

实施例5

按照实施例1中的检测体系，向体系中加入100nm的牛血清蛋白(bsa)和免疫球蛋白g(igg)样品，观察溶液是否变色并进行紫外可见吸收光谱测试，与加入凝血酶样品后的溶液颜色进行比较。

由图5和图6可见，在该检测系统中加入bsa和igg样品后，534nm处的吸光度值没有明显变化，即使是在加入高浓度样品条件下，其吸光度值的变化远远比不上加入凝血酶样品后溶液在534nm处吸光度值的变化，且只有加入凝血酶样品后溶液颜色发生明显变化且肉眼可见，说明该检测系统特异性优良。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110>中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所

中国科学院宁波材料技术与工程研究所

<120>一种凝血酶检测方法及其试剂盒

<130>dd180103i

<141>2018-05-31

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>thrombin

<400>1

agtccgtggtagggcaggttggggtgact29

<210>2

<211>10

<212>dna

<213>artificiallysynthesized

<400>2

aacctgcctc10