本发明属于生物化学实验技术领域，具体涉及一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法。
背景技术：
近年来，分子生物学得到迅猛发展，聚合酶链式反应(pcr)是一种简便、准确的核酸定量检测技术。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯dna片段的标准方法，是分子生物学的核心技术之一。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具有亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。dna在碱性条件下(ph8.0的缓冲液)带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同dna分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭(ethidiumbromide,eb)可嵌入dna分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组的目的。
eb是实验室最常用的核酸染料，能使凝胶中的dna和rna很好地着色，从而显示凝胶中核酸的位置。但其具有毒性强、强致突变性、中度致癌性、难以降解转化和净化处理繁琐，对实验者和周围环境都有着较大的危害。
技术实现要素：
为了克服背景技术中的技术问题，本发明提出一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其将新型核酸染料gelred试剂(biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液按1:3000～5000比例配成混合液添加至pcr扩增产物中，实现核酸电泳与染色同时进行，从而取消传统核酸电泳过程的pcr扩增产物染色这一过程，但是却更有利于观察。
一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，包括以下步骤：
步骤1安装凝胶盘，包括：
将量筒、三角瓶、凝胶盘以及齿试样格洗净并晾干；将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封；将凝胶盘置于水平桌面上，并插上齿试样格；
步骤2琼脂糖凝胶的制备，包括制备
用量筒量取5×tbe电泳缓冲液40ml加水至200ml，配置1×tbe稀释电泳缓冲液并倒入三角瓶中；
称取1g-4ginvitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液，盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；将三角瓶放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间1min；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，调整微波炉档位至中高火，设定时间为90s；取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，直至有大气泡产生时停止，继续放入微波炉，直至琼脂糖完全溶解；
步骤3灌胶，包括
将磁力搅拌子放入三角瓶中，并将三角瓶置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却；待三角瓶内的琼脂糖溶液温度冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢地倒入凝胶盘中，以免产生气泡；在每份10μldna样品pcr扩增产物中加入5μlgelred试剂(biotium)与3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液，放置待用；其中3×稀释凝胶加样缓冲液和gelred试剂按3000～5000:1比例进行混合；将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000ml1×tbe稀释电泳缓冲液于电泳槽内；45-60分钟待凝胶凝固后，撕开胶带密封纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，并将齿试样格洗净；
步骤4加样，包括
吸取3μldna样品pcr扩增产物、gelred和3×凝胶加样缓冲液的混合液加入胶孔中，在待测样品左侧的样品孔中加入3μl的dna分子量标记，用作分子量参照；
步骤5电泳，包括
盖上电泳槽的盖子，接上电源连接线，打开电泳仪的电源开关，将按钮调到“打开”状态以及“电压”模式，选择电压100v；
将“电压”档调整至0v，再将按钮调到“关闭”的状态，并关闭电源开关；
步骤6观察，包括
打开电脑中的成像软件，接上凝胶成像系统的电源；戴上手套，将凝胶盘转移到紫外灯台上，取下手套，关闭成像系统的门；打开紫外灯的开关，选择成像软件“菜单”下的“预览”功能，调整曝光时间，单击“拍照”按钮，获取图像，并保存；关闭紫外灯的开关，断开凝胶成像系统的电源，打开成像系统的门；戴上手套，从凝胶盘中将凝胶取出，弃于垃圾袋中，用吸水纸将紫外灯搽拭干净，取下手套；关上成像系统的门，关闭电脑。
进一步的优选技术方案是，所述的步骤2琼脂糖凝胶的制备中从微波炉中取出三角瓶时需戴上防护手套。
进一步的优选技术方案是，所述的步骤3灌胶中磁力搅拌机搅拌的搅拌速度为300r/min-500r/min，以避免产生气泡。
进一步的优选技术方案是，所述的步骤3灌胶中1xtbe稀释缓冲液需浸没凝胶表面约1～2mm。
本发明的有益效果：
本发明将新型核酸染料gelred试剂添加至pcr扩增产物中，实现核酸电泳与染色同时进行，从而取消传统核酸电泳过程的pcr扩增产物染色的步骤，并且更有利于观察。
附图说明
图1为使用本发明方法的凝胶电泳图；
图2为传统使用eb染色的凝胶电泳图；
图3为采用改进的eb染色方法检测核酸琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案、目的、有益效果更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1.
如图1所示，为采用本发明方法提取的凝胶电泳图。
一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，其包括：将量筒、三角瓶、凝胶盘、齿试样格洗净后并晾干，将凝胶盘开口的两侧用胶带纸密封，并将凝胶盘置于水平桌面上，插上齿试样格，量筒用于量取tbe电泳缓冲液。
由于齿试样格一边平口，一边凹口，与凝胶盘是互补设计，插入时，需要注意左右方向。
琼脂糖凝胶的制备
用量筒量取5×tbe电泳缓冲液40ml加水至200ml，配置1×tbe稀释电泳缓冲液并倒入三角瓶中；称取1g-4ginvitrogen琼脂糖粉末，倒入三角瓶中，配成0.5％-2％浓度琼脂糖胶液；盖上牛皮纸，轻轻摇晃三角瓶，使琼脂糖粉末散开；
将三角瓶放入微波炉中，调到微波炉档位至中高火(功率约为80w)，设定时间1min，使用防护手套取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，再次放入微波炉中，再次将档位调到中高火，设定时间90s。
再次使用防护手套取出三角瓶，轻轻摇晃三角瓶，待至有大气泡产生时，粉末已完全溶解；为确保琼脂糖完全溶解，需再次放入微波炉中加热直至完全溶解。
将磁力搅拌子放入三角瓶中，置于装有冷水的容器中，放在磁力搅拌机上搅拌冷却，磁力搅拌机搅拌的搅拌速度为300r/min-500r/min。在磁力搅拌机上的转速不要过大，以免产生很多气泡。
冷却至50℃-60℃，将琼脂糖溶液缓慢倒入凝胶盘中，冷却后的琼脂糖溶液温度不能过高，也不能过低，置于手上，感觉微热，但不烫手即可。
在每份10μldna样品pcr扩增产物中加入5μlgelred试剂(biotium)与3×稀释加样缓冲液的混合液，放置待用，将电泳槽置于水平桌面上，并调整至水平状态，加入2000ml1×tbe稀释电泳缓冲液，约1小时后，待凝胶凝固，撕开胶带纸，将凝胶盘转移到电泳槽中，拔出齿试样格，洗净，tbe缓冲液需浸没凝胶表面1-2mm。
吸取3uldna样品pcr扩增产物、gelred试剂和3×稀释凝胶加样缓冲液的混合液加入样品孔中，在待测样品左侧的凝胶盘胶孔中加入3ul的dna分子量标记，用以作分子量参照。
盖上电泳槽的盖子，接上电源连接线，电压选择100v，开始电泳，电泳完毕后，先将电压降到0v，再将按钮调到“关闭”的状态，最后关闭电源开关。
打开电脑中的成像软件，接上凝胶成像系统的电源。戴上手套，将凝胶转移到紫外灯台上，取下手套，关上成像系统的门，此时不能戴上手套接触电脑和凝胶成像系统。
打开紫外灯的开关，选择成像软件“菜单”下的“预览”功能，调整曝光时间，单击“拍照”按钮，获取图像，并保存。关闭紫外灯的开关，断开凝胶成像系统的电源，打开成像系统的门。戴上手套，将凝胶取出，丢弃于垃圾袋中，用吸水纸将紫外灯台搽拭干净，取下手套，关上成像系统的门，关闭电脑。
实施例2.现有技术传统eb直接加到凝胶中
eb染色的凝胶电泳为图2。
制备dna分子量标准
采用ecori或hindⅲ酶所得的λdna片段来作为电泳时的分子量标准。λdna为长度约50kb的双链dna分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操作如下：
hindⅲ切割dna后得到8个片段，长度分别为23.1，9.4，6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb。
ecori切割idna后得到6个片段，长度分别为21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。
琼脂糖凝胶的制备
取5×tbe缓冲液20ml加水至200ml，配制0.5×tbe稀释缓冲液，待用。
胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入0.5×tbe稀释缓冲液，放入微波炉内加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
胶板的制备：将有机玻璃槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳，注意观察样品梳齿下缘阴雨胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(eb)溶液使其浓度为0.5ug/ml。用移液器吸取少量融化后的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡，待胶完全凝固后拔出树脂，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×tbe稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
加样：取10ul酶解液与2ul6×加样缓冲液混匀，用微量液枪小心加入样品槽中。若dna含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
电泳：加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
染色：未加eb的胶板在电泳完毕后移入0.5ug/ml的eb溶液中，室温下染色20-25min。
观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有eb的电泳胶板。dna存在处显示处肉眼可辩的橘红色荧光条带。紫外灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒。
dna分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量λdna的ecori和hindⅲ酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下dna分子量的标准曲线。
dna酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺测量出dna样品各片段的迁移距离，根据此数值，在dna分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小。反之，若已知dna片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。
dna酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切，双酶切和多酶切的电泳分析结果，对照dna酶切片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图表示，即成该dna分子的限制性内切酶图谱。
实施例3.现有技术改进的核酸琼脂糖凝胶电泳eb染色方法
改进的核酸琼脂糖凝胶电泳如图3所示。
称1g琼脂糖溶于100mltae缓冲液，微波炉中加热，待其冷却至50℃左右时，加5uleb原液于琼脂糖凝胶中，制得不含eb的1％的琼脂糖凝胶一块，取5uleb原液于95ul蒸馏水中记为ebo，再从中取出1ul加入到1ml的溴酚蓝中混合，记为ebo1。上样时前者直接取pcr产物5ul与不含eb的溴酚蓝3ul混合上样，后者将pcr产物5ul与含eb的溴酚蓝(ebo1)3ul充分混合上样，两者在同样条件下进行电泳，在100v电压下电泳15min，紫外灯下检测条带的亮度。
从图1、2和3可以得出，三种电泳染色效果比较接近，然而利用本方法取消传统琼脂糖凝胶染色过程(凝胶染色在电泳过程中进行)的步骤不仅提高了工作效率，还提高电泳实验操作人员人身和周围环境安全性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。