本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种在细胞水平上甜度的定量测定方法。
背景技术：
：人类能够区分的味觉主要分为五种，即酸味、甜味、苦味、鲜味、咸味。大多数的哺乳类动物更加偏好于甜味，甜味的食物通常预示着具有更多能量，而苦味的食物则预示着食物可能对身体有害。哺乳动物的甜味受体细胞主要分布在舌头和颚表皮的味蕾细胞上。在每种感受不同味觉的细胞中，其味觉信号传导通路都不一样。t1r基因家族可以编码三种保守的gpcrs，即t1r1、t1r2和t1r3，t1r2和t1r3结合形成异源二聚体，可以作为甜味受体；t1r1和t1r3结合形成异源二聚体，可以作为鲜味受体。这些味觉配体与味觉受体相互作用，激活级联信号从而导致神经递质释放，接着脑神经中枢的神经纤维会将信号从下丘脑传入味觉皮层中心，味觉皮层中心会将收集的信号进行加工和整合，进而产生相应的味觉感觉。甜味化合物多种多样，其中包括糖类、人工甜味剂、甜蛋白、氨基酸，甜味信号主要是由在ii型味蕾细胞上的t1r2/t1r3二聚体受体感受，甜味信号分子包括简单的碳水化合物(单糖和多糖)、d-型氨基酸(大多数)和l-型氨基酸(部分)、人工甜味剂等。相关研究证明甜味信号传导所涉及到的信号分子有α-gustducin、plcβ2、ip3r、trpm5等，目前研究已确定天然甜味物质和人工甜味剂刺激甜味受体所引起的分子信号通路不一样。甜味化合物与甜味受体结合后主要激活两条信号通路。天然甜味物质与甜味受体结合后，激活下游g蛋白，进而激活腺苷酸环化酶(ac)水解atp，产生camp，打开cnmp-门控通道，导致钙离子内流，胞内钙离子浓度升高，camp还可以激活pka，导致小基部外侧钾离子通道磷酸化，从而使离子通道关闭，抑制了钾离子外流，引起细胞膜去极化，电压依赖性钙离子内流，钙离子浓度升高。人工甜味物质与甜味受体结合后，活化下游g蛋白，激活磷脂酶c(plc)，产生ip3和dag，ip3可与内质网膜上的ip3r结合，导致内质网中的钙离子释放，胞内钙离子浓度的升高。两条通路的激活都导致胞内钙离子浓度升高。钙离子作为一个主要的胞内信使，参与并调控多种生理活动。细胞有严密的机制来控制胞内钙离子的平衡，一是依赖于细胞质膜的钙泵及钙通道，二是依靠内质网、线粒体等胞内钙库。在动植物细胞中，钙离子主要以三种形式存在：1.与细胞结构成分或者大分子物质结合，形成结合钙；2.储存在内质网、线粒体等细胞胞内钙库中，为储存钙；3.以离子的形式存在，即游离钙。细胞胞内的储存钙和游离钙可以相互转化，在静止状态下，细胞中的游离钙浓度非常低，大约为10-8-10-7m。当受到刺激时，细胞胞质中的游离钙会迅速升高，可达到10-5m。fluo-4am是fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，其分子式为c51h50f2n2o23，分子量为：1096.95，结构式为：fluo-4am的荧光非常弱，其荧光不会随胞内钙离子浓度升高而增强。fluo-4am进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成fluo-4，从而被滞留在细胞内。fluo-4可以和游离钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。在实际应用激光扫描共聚焦显微镜检测时推荐使用的激光器激发波长为488nm左右，发射波长检测范围为512-520nm。甜度，在一定意义上是反映人的感官对食物口感评价指标，简单来说，表征的是化合物或者食物的甜味程度。在日常生活中，人们通常用感官，也就是舌头来品评甜度。在科学研究中，主要是用各种化学试剂和分析仪器等来检测样品的甜度，但这些仪器只能检测食品中有甜味可溶性固形物的含量，并非真实的样品甜度。所以我们通常根据这些单个甜味物质的含量及单个甜味物质的甜度来定量这些食物或复杂化合物的甜度。目前检测甜度的方法主要分为两大类，分别是分析化学检测方法、生物学方法检测方法。其中分析化学检测方法主要有高效液相色谱法、电子舌检测方法、甜度计检测方法、分光光度计检测方法；生物学方法有人工测评等。分析化学方法检测可以精准的检测到糖分的含量，但无法在生理水平上定量甜度；生物学检测方法虽然可以在生理水平上定量甜度，但是人工测评的主观性较强、人的口味有差异，无法精确定量甜度。目前仍未有一种在生理水平上客观的定量物质甜度的标准方法，建立可以在生理水平上定量化合物甜度方法对于食品及甜味剂开发工作十分重要。技术实现要素：本发明提供了一种基于激光扫描共聚焦显微镜检测单细胞胞内钙离子浓度变化的方法，进而在生理水平上定量甜度。本发明使用的细胞系有两种，分别为hek293细胞系和hek293-t1r2/t1r3细胞系，充分消除细胞本底反应造成的测量差异；所述hek293-t1r2/t1r3细胞系及该细胞系制备方法请参照专利201810425704.1。为了达到上述目的，本发明提供了一种稳定表达甜味受体细胞胞质内钙离子浓度的检测方法。一种在细胞水平上甜度的定量测定方法，包括如下步骤：(1)将贴壁培养的hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞按正常传代步骤进行悬浮细胞的制备，并分别种植于共聚焦培养皿中；(2)当步骤(1)的共聚焦培养皿中的贴壁培养的hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞的汇合度达到40％-60％时，用钙离子荧光探针溶液对种植于共聚焦培养皿中细胞进行孵育；(3)使用激光扫描共聚焦显微镜连续观测记录步骤(2)孵育后的细胞荧光图像至120s，分别获取hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞的单个细胞在120s内各时间点的荧光强度值；设定前16s内最小荧光值为fo，设定16s至120s内最大荧光值为fm；其中在第16s时加入待测甜样品溶液；(4)用△f/fo分别计算hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞的荧光强度变化比率值，其中△f为fm-fo；(5)将hek293-t1r2/t1r3细胞荧光强度变化比率△f/fo值减去hek293细胞荧光强度变化比率△f/fo的值为△r；(6)设定某已知浓度下蔗糖溶液的甜度为1，f/fo的值为△rs；则步骤(5)得到的△r值与△rs的比值，即为待测甜样品溶液的相对甜度。优选地，步骤(1)中所述共聚焦培养皿为适用于在激光共聚焦显微镜上进行油镜观测的细胞培养皿。优选地，所述共聚焦培养皿的规格为外径35mm，内径10mm；所述共聚焦培养皿在使用前需要用25μg/ml多聚赖氨酸溶液在37℃孵育30min。优选地，步骤(2)中所述的钙离子荧光探针为fluo-4am，且其在flex缓冲液中的浓度10μm。优选地，所述flex缓冲液包括如下表所示的成分：试剂体积(ml)hbss溶液47.5hepes溶液11mmgso40.051mna2co30.1651mcacl20.06510％bsa牛血清白蛋白0.5250mmprobenecid0.5总计50所述hbss溶液即hanks的平衡盐溶液，为商购thermo公司产品，具体成分见下表：成分浓度(mg/l)浓度(mm)cacl2(无水)1401.261261mgcl2·6h2o1000.492611mgso4·7h2o1000.406504kcl4005.333334kh2po4600.441176nahco33504.166667nacl8000137.931na2hpo4(无水)480.338028d-glucose10005.555555hepes为n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙烷磺酸，所述hepes溶液为商购thermo公司产品，hepes浓度为1m，ph值为7.2-7.5；所述probenecid为丙磺舒。优选地，所述flex缓冲液的ph＝7.4。优选地，步骤(2)所述用钙离子荧光探针溶液对种植于共聚焦培养皿中细胞进行孵育的条件为：避光37℃下孵育45-60min，使贴壁细胞覆盖培养皿底部的面积达到40％-60％。优选地，步骤(3)所述的激光扫描共聚焦显微镜的型号为fv1000型；拍摄参数设置为：物镜为60倍油镜，激光管为氖离子激光器，激发波长为488nm，发射波长范围为500nm-600nm，扫描速度为8μs/pixel，像素为640x640，采用xyt扫描程序对细胞进行无损伤连续扫描拍照，在室温、避光条件下扫描4min，获取总帧数为不少于30张荧光图片；然后将获得的连续观测荧光图像用imagej软件对荧光图像上的单细胞进行荧光定量，获得120s内单个细胞的荧光值。优选地，步骤(6)所述某已知浓度下蔗糖溶液的甜度为1的蔗糖溶液浓度为150mm。一种在细胞水平上甜度的定量测定方法的具体包括如下步骤：(1)将贴壁培养的hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞按正常传代步骤进行悬浮细胞的制备；具体为将铺满培养皿的hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞移除培养液，用5ml磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)洗涤两次，用1ml0.25％的胰蛋白酶(trypsin)溶液消化细胞2min，加入新鲜的培养液中止，转移至15ml离心管中，180g离心5min，除去上层清液；向在下层沉淀中加入1ml新鲜培养液，进行悬浮细胞的制备，混匀得到细胞悬浮液；(2)另取一只1.5mlep离心管，在管中先加入990μl新鲜培养液，再加入10μl步骤(1)得到的细胞悬浮液，混匀；(3)取出10μl步骤(2)中制得的细胞悬液，加入到25格×16格的血球计数板中，在光学显微镜镜下计数，确定细胞浓度；依据测定的细胞浓度对上述步骤(1)细胞悬液进行稀释，制备工作浓度为105cells/ml的细胞悬液；取1ml浓度约为105cells/ml的细胞悬浮液加入到35mm共聚焦培养皿中，置于37℃恒温细胞培养箱中进行培养；本发明使用的是25格×16格的血球计数板，细胞浓度计算公式为：细胞个数/ml＝4个大方格细胞总数/4×10000×10000。上述公式请参考有关文献(周柬明，血球计数板的使用相关计算，《新高考(高三理化生)》，2013年4期,61-64)(4)将步骤(2)的细胞悬浮液接种至共聚焦培养皿培养24h后，在光学显微镜下观察，当观察到细胞覆盖培养皿底部的面积达到40％-60％时，除去培养皿中的培养液，然后向培养皿中加入1ml含有fluo-4am(thermofisher，f14202)荧光探针(10μm)的缓冲液，继续在37℃恒温细胞培养箱中避光培养45-60min，得到fluo-4荧光探针标记的细胞；(5)用fv1000激光扫描共聚焦显微镜测定步骤(4)中fluo-4荧光探针标记的细胞在不同条件下细胞内fluo-4与钙离子结合后的所发射的荧光强度；在fv1000扫描激光共聚焦显微镜开始扫描后的第16s时，向培养皿中加入待检测的甜样品溶液，继续对细胞进行扫描拍照，获得荧光图片；所述激光共聚焦扫描显微镜的参数设置为：物镜为60倍油镜，激光管为氖离子激光器，激发波长为488nm，发射波长范围为500nm-600nm，扫描速度为8μs/pixel，像素为640x640，采用xyt扫描程序对细胞进行无损伤连续扫描拍照，在室温，避光条件下扫描4min，获取总帧数不少于30张荧光图片；(6)将步骤(5)获得荧光图片用imagej软件分析单个细胞在前2min内连续变化的荧光强度；选取前16s内的最低荧光值，设定为fo，选取前120s内的最大荧光值设定为fm，单个细胞荧光强度变化比率用△f/fo＝(fm-fo)/fo公式进行计算；用计算出的hek293-t1r2/t1r3细胞荧光变化比率△f/fo减去hek293细胞的胞内荧光变化比率△f/fo，得到hek293-t1r2/t1r3细胞和hek293细胞之间胞内荧光强度变化比率差值△r。我们定义某已知浓度下蔗糖溶液的甜度为1(比如定义150mm蔗糖甜度为1)，hek293-t1r2/t1r3细胞和hek293细胞之间胞内荧光强度变化比率差值为△r反映待检测糖溶液的甜度；荧光变化比率差值△r越大，则检测糖溶液的甜度越大。其中，步骤(3)所述fluo-4am荧光探针溶液含有10μm的flex缓冲液稀释，所述flex缓冲液的组成为：试剂体积(ml)hbss溶液47.5hepes溶液11mmgso40.051mna2co30.1651mcacl20.06510％bsa牛血清白蛋白0.5250mmprobenecid0.5总计50所述hbss溶液即hanks的平衡盐溶液，为商购thermo公司产品(catno.14025092)，具体成分见下表：成分浓度(mg/l)浓度(mm)cacl2(无水)1401.261261mgcl2·6h2o1000.492611mgso4·7h2o1000.406504kcl4005.333334kh2po4600.441176nahco33504.166667nacl8000137.931na2hpo4(无水)480.338028d-glucose10005.555555hepes表示n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙烷磺酸，所述hepes溶液为商购thermo公司产品(catno.15630080)，hepes溶液浓度为1m，ph值为7.2-7.5；所述probenecid为丙磺舒。本发明的测定方法相比于现有检测甜味技术的优势在于：1、本发明通过检测稳定表达人源甜味受体的活细胞内钙离子浓度变化来评定化合物的甜度，可以在生理水平上反应甜度。而不是像现有的分析化学检测方法和生物学方法检测方法检测食品中甜味可溶性固形物的含量，然后根据这些单个甜味物质的含量来定量这些食物或复杂化合物的甜度。这些测定的并非真实化合物的甜度。2、本发明的测定方法在细胞水平上模拟人源甜味受体对甜味物质的感知程度，从细胞水平上定量人源甜味受体对甜味物质感知程度，可在离体情况下定量人对其他未知样品甜味的感知程度。本发明在体外建立一个稳定的甜度检测平台，可以有效避免人类主观因素的影响。本发明的方法可以快速、高效、高灵敏检测化合物甜度，具有良好的应用前景。具体实施方式实施例1150mm蔗糖溶液下，hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞胞内钙离子浓度变化：(1)共聚焦培养皿中种植细胞：将共聚焦专用培养皿(外径35mm，内径10mm)用1ml多聚赖氨酸(25μg/ml)37℃孵育30min，用磷酸缓冲液(10mm，ph7.4)清洗三次，再将细胞按比例传代到共聚焦培养皿中。待培养皿中细胞贴壁生长24h-48h，在光学显微镜下观察到细胞覆盖培养皿底部的面积达到40％-60％。(2)配置flex缓冲液(ph＝7.4)试剂体积(ml)hbss溶液47.5hepes溶液11mmgso40.051mna2co30.1651mcacl20.06510％bsa牛血清白蛋白0.5250mmprobenecid0.5总计50所述hbss溶液即hanks的平衡盐溶液，为商购thermo公司产品，具体成分见下表：成分浓度(mg/l)浓度(mm)cacl2(无水)1401.261261mgcl2·6h2o1000.492611mgso4·7h2o1000.406504kcl4005.333334kh2po4600.441176nahco33504.166667nacl8000137.931na2hpo4(无水)480.338028d-glucose10005.555555hepes表示n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙烷磺酸；所述hepes溶液为商购thermo公司产品(catno.15630080)，浓度为1m，ph值为7.2-7.5；所述probenecid为丙磺舒。(3)荧光探针标记细胞：将配置好的flex缓冲液放在37℃水浴锅中温浴30min。将10μl浓度为10mm的fluo-4am稀释到10mlflex缓冲液，得到fluo-4am(10μm)稀释液，避光。除去共聚焦培养皿中的培养液，每皿加入1ml的fluo-4am(10μm)稀释液，37℃避光培养45-60min。培养结束后，除去fluo-4am稀释液(10μm)，加入1mlflex缓冲液清洗一遍。每皿加入1mlflex缓冲液，以备后续fv1000激光扫描共聚焦显微镜检测。(4)激光共聚焦扫描显微镜获取xyt轴荧光图片按顺序打开激光扫描共聚焦显微，打开488nm激发光激光器；打开软件，调节扫描速度为8μs/pixel，像素为640x640，打开时间轴扫描模式，激发光为488nm，接受光通道为500nm-600nm；将物镜调节为60倍镜，在镜头上滴加一滴香柏油，将培养皿固定在在载物台上方；将镜头上升，使香柏油与培养皿下表面接触，再调节细准焦螺旋寻找细胞，直至在目镜下可清楚观察到细胞形态；寻找细胞形态好，分散均匀的视野(方便后续荧光定量)；快速扫描荧光图像，通过调节激发光强度、hv(增强图像信号)、gain(增强信号)、offset(扣除背景)以及焦平面，得到能清晰地扫描出细胞中钙离子荧光图像；用移液枪将培养皿中的flex缓冲液移除，再次调节焦平面；开始扫描荧光图像，扫描时长为4min，总帧数为60；开始扫描后的第16s时，在检测目的细胞周围悬空滴加200μl的150mm蔗糖溶液(切勿触碰培养皿，防止视野移动)；等待扫描时间结束，保存图像数据，后续进行数据收集和处理。(5)定量单细胞胞内钙离子浓度变化将图像文件在imagej软件中打开，在(4)步骤中拍摄的荧光图片中随机选取三个视野，每个视野中有2-3个细胞，分别提取细胞在各帧图像的荧光数值。以前16s的最低荧光值为fo，以前2min的最大荧光值为fm，依以下公式获得单个细胞的荧光变化比值：△f/fo＝(fm-fo)/fo；对图像文件中多个细胞的荧光变化比值平均，将hek293-t1r2/t1r3细胞荧光强度变化比率△f/fo值减去hek293细胞荧光强度变化比率△f/fo的值即得到荧光变化比值△rs，其值为0.284。实施例250mm蔗糖刺激下，hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞胞内钙离子浓度变化，步骤和条件同实施例1。得到荧光变化比值△r为0.105。设定实施例1的150mm蔗糖溶液的甜度为1，则△r/△rs值为0.370，则本实施例50mm的蔗糖溶液相对甜度为0.370。实施例3250mm蔗糖刺激下，hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞胞内钙离子浓度变化，步骤和条件同实施例1。得到荧光变化比值△r为0.487。设定实施例1的150mm蔗糖溶液的甜度为1，则△r/△rs值为1.71，则本实施例250mm的蔗糖溶液的相对甜度为1.71。实施例4150mm葡萄糖刺激下，hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞胞内钙离子浓度变化，步骤和条件同实施例1。得到荧光变化比值△r为0.224。设定实施例1的150mm蔗糖溶液的甜度为1，则△r/△rs值为0.789，则本实施例150mm葡萄糖溶液的相对甜度为0.789。实施例550mm三氯蔗糖刺激下，hek293细胞和hek293-t1r2/t1r3细胞胞内钙离子浓度变化，步骤和条件同实施例1。得到荧光变化比值△r为5.9。设定实施例1的150mm蔗糖溶液的甜度为1，则△r/△rs值为20.7，则本实施例50mm三氯蔗糖的相对甜度为20.7。当前第1页12