本发明实施例涉及免疫测定技术领域，更具体地，涉及一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液及制备方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
elisa基本原理是：(1)使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。(2)使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
目前行业内使用的样品稀释液基本都通用为pbst液，由十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温20组成。优点是生产成本低廉，缺点是仅有盐缓冲液而无法对样本待测物进行有效保护，且与血清环境有较大区别，基质效应明显，影响检测结果的准确性和重复性。
技术实现要素：
本发明实施例提供了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液及制备方法。
第一方面，本发明实施例提供了一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液，包括：
四甲基联苯胺tmb底物溶液，所述tmb底物溶液由柠檬酸缓冲液、过氧化氢尿素、聚乙烯吡咯烷酮pvp、二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积混合液、2％w/v聚乙二醇peg制成，余量为纯化水；
取850ml所述柠檬酸缓冲液，并加入100mg过氧化氢尿素，待充分溶解后，于4℃贮存1周，然后加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，使其浓度至0.3％w/v，然后4℃过放置12h后加入预先用二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积比1∶10混合液溶解并避光保存的100mgtmb中，再加入2％w/v聚乙二醇peg，并将总体积定容到1000ml。
柠檬酸缓冲液，每升柠檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸。
第二方面，本发明实施例提供了一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液制备方法，包括：
步骤一、称取0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸置于容器中，量取1000ml纯化水加入容器中，搅拌至完全溶解，得到柠檬酸缓冲液；
步骤二、制备四甲基联苯胺tmb底物溶液，取850ml所述柠檬酸缓冲液，并加入100mg过氧化氢尿素，待充分溶解后，于4℃贮存1周，然后加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，使其浓度至0.3％w/v，然后4℃过放置12h后加入预先用二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积比1∶10混合液溶解并避光保存的100mgtmb中，再加入2％w/v聚乙二醇peg，并将总体积定容到1000ml。
作为优选的，所述步骤二中，并加入100mg过氧化氢尿素后，还包括：
称取15g的血清蛋白加入柠檬酸缓冲液中，继续搅拌3-5分钟后，加入2ml液体防腐剂。
作为优选的，所述液体防腐剂为proclin300。
作为优选的，所述血清蛋白为牛血清白蛋白。
本发明实施例提供的一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液及制备方法，选择了dmso作为tmb的溶剂，并将peg也加到体系中，致使溶液的极性显著降低。在此基础上加入一定量的无水乙醇，这种组合不仅解决了tmb的溶解性，而且乙醇还能起到防腐剂的作用。先将过氧化氢尿素溶于底物缓冲液中，于4℃贮存1周后加入pvp，当此溶液充分平衡后，再与事先配制好的tmb溶液缓慢混合，然后避光保存于4℃，于不同时间检测其稳定性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
邻苯二胺(opd)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)等可作为提高检测敏感性的发色剂。opd对人和动物具致癌性，但tmb不仅致癌性降低，而且敏感性高，因此已被广泛应用于酶联免疫吸附试验(elisa)检测。众所周知，当tmb和过氧化氢处于同一溶液体系时，因发生氧化而失去活性。现有技术通过分别制备了tmb和过氧化氢的贮存液(a/b两组分)，通过现场混合，较好地解决了tmb底物的敏感性和稳定性问题，该技术目前在国内仍被广泛采用。
但是在elisa检测过程中，a/b两组分底物与即用型底物相比，不仅使操作复杂化，而且还增加了系统误差。
针对现有技术中的上述缺陷，本发明实施例提供的一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液，包括：
四甲基联苯胺tmb底物溶液，所述tmb底物溶液由柠檬酸缓冲液、过氧化氢尿素、聚乙烯吡咯烷酮pvp、二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积混合液、2％w/v聚乙二醇peg制成，余量为纯化水；
取850ml所述柠檬酸缓冲液，并加入100mg过氧化氢尿素，待充分溶解后，于4℃贮存1周，然后加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，使其浓度至0.3％w/v，然后4℃过放置12h后加入预先用二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积比1∶10混合液溶解并避光保存的100mgtmb中，再加入2％w/v聚乙二醇peg，并将总体积定容到1000ml。
柠檬酸缓冲液，每升柠檬酸溶液含0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸。
在本实施例中，由于tmb分子上4个甲基的存在，尽管降低了致癌性，但也使其水溶性显著降低，甚至在底物溶液中的溶解度无法达到免疫检测水平。因此，为提高其溶解性，dmso、甲酰胺、乙酰胺、甲醇及酯类等已成功作为tmb的溶剂。底物溶液中的另一组分-过氧化氢，因不存在溶解难的问题，故可直接加到底物缓冲液中。鉴于tmb和过氧化氢在同一体系中不稳定的特性，目前多数试剂盒采用只含tmb/过氧化氢的a/b两组分体系，并以硫酸庆大霉素为防腐剂，在显色时只需将两者等比例混合即可。由于该体系无法控制真菌类污染物，特别不适用于多次长时间使用。
本实施例中选择了dmso作为tmb的溶剂，并将peg也加到体系中，致使溶液的极性显著降低。在此基础上加入一定量的无水乙醇，这种组合不仅解决了tmb的溶解性，而且乙醇还能起到防腐剂的作用。此外，pvp在医药上常作为增稠剂,本实施例中首先将过氧化氢尿素溶于底物缓冲液中，于4℃贮存1周后加入pvp，当此溶液充分平衡后，再与事先配制好的tmb溶液缓慢混合，然后避光保存于4℃,于不同时间检测其稳定性，tmb底物在敏感性及稳定性等方面均优于目前常规的a/b型两组分底物。
本发明实施例提供了一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液制备方法，包括：
步骤一、称取0.386g二水磷酸二氢钠、1.93g十二水磷酸氢二钠和8.2g柠檬酸置于容器中，量取1000ml纯化水加入容器中，搅拌至完全溶解，得到柠檬酸缓冲液；
步骤二、制备四甲基联苯胺tmb底物溶液，取850ml所述柠檬酸缓冲液，并加入100mg过氧化氢尿素，待充分溶解后，于4℃贮存1周，然后加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，使其浓度至0.3％w/v，然后4℃过放置12h后加入预先用二甲基亚砜dmso和无水乙醇按体积比1∶10混合液溶解并避光保存的100mgtmb中，再加入2％w/v聚乙二醇peg，并将总体积定容到1000ml。
在本实施例中，由于tmb分子上4个甲基的存在,尽管降低了致癌性，但也使其水溶性显著降低，甚至在底物溶液中的溶解度无法达到免疫检测水平。因此，为提高其溶解性,dmso、甲酰胺、乙酰胺、甲醇及酯类等已成功作为tmb的溶剂。底物溶液中的另一组分-过氧化氢，因不存在溶解难的问题，故可直接加到底物缓冲液中。鉴于tmb和过氧化氢在同一体系中不稳定的特性，目前多数试剂盒采用只含tmb/过氧化氢的a/b两组分体系,并以硫酸庆大霉素为防腐剂，在显色时只需将两者等比例混合即可。由于该体系无法控制真菌类污染物，特别不适用于多次长时间使用。
本实施例中选择了dmso作为tmb的溶剂，并将peg也加到体系中,致使溶液的极性显著降低。在此基础上加入一定量的无水乙醇，这种组合不仅解决了tmb的溶解性，而且乙醇还能起到防腐剂的作用。此外，pvp在医药上常作为增稠剂,本实施例中首先将过氧化氢尿素溶于底物缓冲液中，于4℃贮存1周后加入pvp，当此溶液充分平衡后，再与事先配制好的tmb溶液缓慢混合，然后避光保存于4℃,于不同时间检测其稳定性，tmb底物在敏感性及稳定性等方面均优于目前常规的a/b型两组分底物。
在本实施例中，为了降低缓冲液中溶解氧的含量，对于底物缓冲液先进行了高压灭菌，并在其中加入了适量的还原剂，这样不仅降低了游离氧的含量，而且杀灭了其中的微生物。
采用以过氧化氢尿素替代了常用的双氧水，并在其中加入增稠剂，降低了溶液中过氧化氢分子与tmb分子相互接触的概率，有利于底物溶液的稳定保存。
在上述各实施例的基础上，所述步骤二中，并加入100mg过氧化氢尿素后，还包括：
称取15g的血清蛋白加入柠檬酸缓冲液中，继续搅拌3-5分钟后，加入2ml液体防腐剂。
在上述各实施例的基础上，所述液体防腐剂为proclin300。
在上述各实施例的基础上，所述血清蛋白为牛血清白蛋白。
综上所述，本发明实施例提供的一种提高检测灵敏度的elisa样本稀释液及制备方法，选择了dmso作为tmb的溶剂，并将peg也加到体系中，致使溶液的极性显著降低。在此基础上加入一定量的无水乙醇，这种组合不仅解决了tmb的溶解性，而且乙醇还能起到防腐剂的作用。先将过氧化氢尿素溶于底物缓冲液中，于4℃贮存1周后加入pvp，当此溶液充分平衡后，再与事先配制好的tmb溶液缓慢混合，然后避光保存于4℃，于不同时间检测其稳定性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。