一种用液相色谱法分离测定卡格列净及其杂质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用液相色谱法分离测定卡格列净及其杂质的方法。

背景技术：

卡格列净为改善血糖控制的糖尿病新型药物，最先由美国强生旗下的杨森公司开发上市，是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sglt2)的抑制剂，用于改善2型糖尿病成年患者的血糖控制。卡格列净的分子式为c24h25fo5s，化学结构式见下式（i）化合物，其化学名为：(2s,3r,4r,5s,6r)-2-(3-((5-(4-氟苯基)噻吩-2-基)甲基)-4-甲基苯基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇，

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在合成卡格列净的过程中，会产生杂质2-(5-丁基-2-甲基苯基)-5-(4-氟苯基)噻吩(简称imbu)和(3-((5-(4-氟苯基)噻吩-2-基)甲基)-4-甲基苯基)三甲基硅烷（简称fmts），在贮存或生产过程中会产生降解杂质(2s,3r,4r,5s,6r)-2-(3-((5-(4-氟苯基)噻吩-2-基)(羟基)甲基)-4-甲基苯基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇(简称imht)和2-(4-氟苯基)-5-(2-甲基-5-((2s,3r,4r,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-2-基)苄基)噻吩-1,1-二氧化物（简称imso2），杂质imso2、imht、fmts和imbu的化学结构式见下：

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本发明人发现，采用常规一般c18和常规流动相的hplc的测定方法难以将卡格列净与杂质imht、imso2、fmts、imbu有效分离，峰形很差，柱效很低，且完全重合在一起。

为了有效控制卡格列净的质量，有必要研究出一种能将卡格列净及其4个杂质有效分离的hplc测定方法，实现卡格列净原料药和制剂的质量控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用液相色谱法分离测定卡格列净及其杂质的方法，该方法将卡格列净与其杂质imht、imso2、fmts、imbu化合物有效分离测定，实现卡格列净的质量控制。

在一实施方案中，本发明的一种用液相色谱法分离测定卡格列净及其杂质的方法，所述杂质为imht、imso2、imbu、fmts，该方法包括：1)色谱柱为健合型手性色谱柱，2)以醋酸铵缓冲液为流动相a，以乙腈为流动相b，3)流动相a的体积比为20%~60%，流动相b的体积比为40%~80%，

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上述本发明的方法，所述键合型手性柱为硅胶表面共价健合直链淀粉，优选

为直链淀粉－三(3-氯苯基氨基甲酸酯)；醋酸铵缓冲液的浓度为0.01mol/l。

上述本发明的方法，优选的，所述流动相a的体积比为20%~50%，流动相b的体积比为50%~80%，采用梯度洗脱法，其优选条件如下表1，

表1梯度洗脱条件

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上述本发明的方法，还进一步包含以下步骤：

a）分别精密称取杂质imht、imso2、imbu、fmts及卡格列净对照品各约18mg分别置100ml容量瓶中，加乙腈适量，超声处理使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液i及卡格列净对照品贮备液i，再精密量取5ml置于50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液ii及卡格列净对照品贮备液ii，再分别取上述杂质贮备液ii及卡格列净对照品贮备液ii各5ml置同一个100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

b）取卡格列净样品，精密称量，置50ml量瓶，加稀释剂使溶解，用并稀释至刻度，制成每1ml含卡格列净0.1至1mg的样品溶液作为供试品溶液，精密量取0.15ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

c）设置流动相的流速为0.4～1.0ml/min，检测波长为210nm～290nm，色谱柱的柱温为20℃至30℃；进样量为5μl至100μl；

d）取相同体积的步骤a）的混合对照溶液、步骤b)的供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，完成卡格列净及其杂质的分离测定。

上述本发明的方法，步骤a）所述稀释剂选自乙腈与水或醋酸铵缓冲液的混合物。

上述本发明的方法，步骤a）所述稀释剂，其中，乙腈与水或醋酸铵缓冲液的体积比为50：50。

上述本发明的方法，优选的，步骤c）中所述流动相的流速为0.5ml/min，所述检测波长为220nm，所述色谱柱的柱温为25℃，所述进样量为20μl。

在一具体实施方案中，本发明的方法，其色谱条件如下：

仪器：agilent1260高效液相色谱仪

色谱柱：chiralpakid，4.6mm×250mm，5μm；

进样量：20μl；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：220nm；

稀释剂：乙腈：水（50:50）

流动相：以0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；按梯度洗脱法，其条件见表1。

本发明的方法的有益效果：由于卡格列净与杂质imht、imso2、fmts、imbu的结构相似、极性相似，采用常规的方法难将它们有效分离，而本发明的方法能将格列净与杂质（imht、imso2、fmts、imbu）有效分离，能准确测定卡格列净及四个杂质（imht、imso2、fmts、imbu），而且峰形对称，柱效较高，从而可以准确控制卡格列净的质量。且方法简单、快速、准确性高、专属性好。

特别是优选的具体实施方案，如选用乙腈：水（50：50）作为稀释剂溶解样品，避免样品在流动相中析出，采用100%乙腈的溶解杂质对照品贮备液，确保杂质的溶解性，再用稀释剂稀释到刻度，既能保证样品溶解，又避免了产生较大的溶剂峰干扰；柱温为25℃，柱温耐用性好，峰形较好，又能让分离度达到最佳。流动相采用梯度洗脱，保证四个杂质（imht、imso2、fmts、imbu）在一个系统完成检测。提高工作效率。本发明解决了分离测定卡格列净的两组结构相似杂质（imht、imso2、fmts、imbu）难分离的问题，从而保证了卡格列净及其制剂的质量可控。

附图说明

图1空白溶剂的液相色谱图；

图2卡格列净与杂质（imht、imso2、cana、fmts、imbu）定位液相色谱图（2-1、2-2、2-3、2-4、2-5）；

图3杂质（imht、imso2、fmts、imbu）与卡格列净对照品混合液相色谱图；

图4卡格列净供试品与杂质（imht、imso2、fmts、imbu）混合的液相色谱图；

图5卡格列净供试品溶液的液相色谱图；

图60.15%对照溶液的液相色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明和理解本发明的精神，但不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

仪器与条件

美国agilent1260型液相色谱仪及instrument工作站；自动进样；

色谱柱：以chiralpakid（5μm，250×4.6mm）；

检测波长：220nm；

流速：0.5ml/min；

进样量：20μl；

柱温：25℃；

稀释剂：乙腈：水（50:50），

流动相：以0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；

按表1梯度洗脱进样。

检测步骤：

空白溶液（稀释剂）：取水500ml和乙腈500ml，混匀，即得（见图1）。

杂质贮备液的配制：分别精密称取杂质imht、imso2、imbu、fmts及卡格列净对照品各约18mg分别置100ml容量瓶中，加乙腈适量，超声处理使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液i及卡格列净对照品贮备液i，再精密量取5ml置于50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液ii及卡格列净对照品贮备液ii。

定位溶液的配制：分别取上述杂质贮备液i及卡格列净对照品贮备液i各0.5ml置不同的100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得各定位溶液（见图（2-1、2-2、2-3、2-4、2-5）。

混合对照品溶液的配置：别取上述杂质贮备液ii及卡格列净对照品贮备液ii各5ml置同的100ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得（见图3）。

供试品加杂质对照品溶液的配制：取卡格列净样品30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加杂质贮备液ii2.5ml再加少量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品加杂质对照品溶液（见图4）。

分别取空白溶液、定位溶液、混合对照溶液、供试品加杂质对照品溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图；结果见图1、图2、图3、图4。

图2（2-3）中保留时间为10.198min的色谱峰为卡格列净色谱峰，

图2（2-1）中保留时间为7.645min是杂质imht、（2-2）中保留时间为8.761min是杂质imso2、（2-4）中保留时间为26.482min是杂质fmts、（2-5）中保留时间为28.057min是杂质imbu的色谱峰为各杂质的色谱峰，

图1证明流动相不干扰测定，

图4表明本法可以有效检测卡格列净的杂质（imht、imso2、fmts、imbu），分离度均大于1.5，可以用于卡格列净的杂质（imht、imso2、fmts、imbu）测定。

实施例2

仪器与条件（实施例1）

美国agilent1260型液相色谱仪及instrument工作站；自动进样；

色谱柱：以chiralpakid（5μm，250×4.6mm）；

检测波长：220nm；

流速：0.5ml/min；

进样量：20μl；

柱温：25℃。

稀释剂：乙腈：水（50:50），

流动相：以0.01mol/l醋酸铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b；

按附表1梯度洗脱进样。

检测步骤：

取本品约30mg，精密称量，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取0.15ml，置100ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液除溶剂峰和系统峰外，在卡格列净杂质（imht、imso2、fmts、imbu）对应处如有色谱峰，按照自身对照加校正因子法计算其含量，如果在杂质（imht、imso2、fmts、imbu）对应处没有出现色谱峰，则无需计算含量。结果见图5、图6。

对比实施例1

仪器与条件：

美国agilent1260型液相色谱仪及instrument工作站；自动进样；

色谱柱：丁烷基硅烷键合硅胶为填充剂（inertsilc4，4.6mm×250mm，5μm）；

进样量：20μl；柱温：25℃；

检测波长：210nm；

采集时间：85分钟；

稀释剂：乙腈

流动相：以水溶液（取纯化水适量，用磷酸调ph值为3.5）为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表2的条件做梯度洗脱：

表2梯度洗脱表

检测步骤：

空白溶液（稀释剂）：取水600ml和乙腈400ml，混匀，即得。

杂质贮备液的配制：分别精密称取杂质imht、imso2、imbu、fmts及卡格列净对照品各约18mg分别置100ml容量瓶中，加乙腈适量，超声处理使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液及卡格列净对照品贮备液i，再精密量取5ml置于50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液及卡格列净对照品贮备液ii。

供试品溶液的配制：取本品30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加杂质贮备液ii2.5ml再加少量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为本案例的供试品溶液。

精密量取供试品加杂质对照品溶液20μl按上述色谱条件进样，结果：imht、imso2在6分多钟出峰，起重叠在一起，imbu、fmts在60分种出峰，不仅分离差（分离度小于1.0），而且分析时间长。故需要寻找更好的分离条件。

对比实施例2-5

仪器与条件：

美国agilent1260型液相色谱仪及instrument工作站；自动进样；

进样量：20μl；

柱温：25℃；

检测波长：210nm；

稀释剂：乙腈

其它条件见下表3

测定步骤：

空白溶液（稀释剂）：取水600ml和乙腈400ml，混匀，即得。

杂质贮备液的配制：分别精密称取杂质imht、imso2、imbu、fmts及卡格列净对照品各约18mg分别置100ml容量瓶中，加乙腈适量，超声处理使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得杂质贮备液及卡格列净对照品贮备液i，再精密量取5ml置于50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即分别得杂质贮备液及卡格列净对照品贮备液ii。

供试品溶液的配制：取本品30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加杂质贮备液ii2.5ml再加少量稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为本案例的供试品溶液。

取供试品溶液20μl按下表3的不同色谱柱、缓冲液（流动相a）、流动相比列（流动相a与流动相b乙腈的体积比）及流速进行测试，结果见表3，

表3不同色谱柱和流动相a缓冲液条件获得的测定结果

由上表3的结果表明，在色谱柱为丁烷基硅烷键合硅胶或c18(inertsilods-3)柱，以及流动相a为水或磷酸二氢钾（钠）溶液的条件下，卡格列净与杂质不能很好分离。

在不偏离本发明的精神实质的条件下进行简单的替换或修饰，也属于本发明的范围。