白桦脂酸用作区分栀子-连翘药对单煎混合液和混煎液的标志物的用途的制作方法

本发明属于检测分析领域，具体涉及白桦脂酸用作区分栀子-连翘药对单煎混合液和混煎液的标志物的用途。

背景技术：

配伍是中药一大特色，研究中药配伍对于揭示中药复方防病治病的作用机制具有重要意义，药对是中药配伍的一种特殊形式，是目前研究中药配伍的一种有效形式。连翘、栀子为临床常用清热解毒中药，常在一起作为药对配伍使用。连翘味苦微寒，轻清而浮，功能透达表里，长于清心泻火，解散上焦之热，还能宣畅气血以散血积气聚；栀子苦寒清降，性缓下行，能清心肺三焦之火而利小便，还能凉血止血。两药皆为苦寒之品，配伍使用，相辅相成，共奏清心除烦、凉血解毒之功。

配伍的药对通常是混煎，但临床常出现单煎后混合的现象。研究发现，单煎或混煎对栀子-连翘药对的药效可能存在一定影响，因此，有必要对栀子-连翘药对的煎煮方式加以区分。

孟祥乐等采用高效液相色谱法对连翘、栀子的单味药提取液及连翘、栀子药对提取液中连翘苷和栀子苷的含量进行了测定，结果发现各成分提取量在单药煎液与药对煎液中变化不明显(参考文献：药对连翘与栀子配伍前后主要化学成分变化研究，中药新药与临床药理2010年9月第21卷第5期)。孟祥乐等还建立了栀子、连翘、栀子-连翘药对hplc指纹图谱，研究了栀子-连翘药对配伍前后指纹图谱变化情况，并研究了栀子-连翘药对配伍前后主要化学成分栀子苷、连翘苷的变化情况，结果发现栀子-连翘药对配伍前后指纹图谱未发生显著变化，栀子-连翘药对配伍前后主要指标性成分栀子苷、连翘苷未发生明显变化(参考文献：栀子-连翘药对配伍的指纹图谱及主要化学成分研究，中国新药杂志2015年第24卷第8期)。

上述现有技术之所以没有发现区分单药煎液与药对煎液的指标性成分，是因为其使用检测器为紫外检测器，其灵敏度、分辨率远远不如现行q-tof/ms，不能更大程度的暴露单煎液、混煎液中化学成分信息差异。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，发现并提供了白桦脂酸用作区分栀子-连翘药对单煎混合液和混煎液的标志物的用途。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

白桦脂酸用作区分栀子-连翘药对单煎混合液和混煎液的标志物的用途；所述单煎混合液为栀子水煎液与连翘水煎液的混合液，该混合液对应的栀子质量与对应的连翘质量为1:1，所述混煎液为栀子与连翘按照质量比1:1混合后的水煎液。

一种鉴定栀子-连翘药对水煎液为单煎混合液或混煎液的方法，所述单煎混合液为栀子水煎液与连翘水煎液的混合液，该混合液对应的栀子质量与对应的连翘质量为1:1，所述混煎液为栀子与连翘按照质量比1:1混合后的水煎液，以白桦脂酸为标志物。

有益效果：

本发明发现白桦脂酸在栀子-连翘药对的单煎混合液和混煎液中存在显著差异，可以用作区分栀子-连翘药对单煎混合或混煎的标志物。

附图说明

图1为负离子模式下uplc-q-tof/ms总离子流图；

图2中a为负离子模式下单煎混合液、混煎液pls-da分布图(n＝8)r²y＝0.995,q²＝0.983；b为置换检验评价pls-da模型(n＝200)r²＝0.597,q²＝-0.313。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、试验材料

栀子、连翘生药干燥品购自亳州中药材市场，干燥后粉碎，阴凉处保存备用。

白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、连翘苷、胡萝卜甾醇、mussaenosidicacid、新绿原酸、藏红花酸、西红花苷i、西红花苷ii、6’-o-trans-sinapoylgeniposide、13-反式-西红花苷i、异槲皮苷的对照品自制或购买，纯度≥98％。

uplc-q-tof/ms使用的溶剂为质谱级。

二、试验方法

1、栀子-连翘药对单煎或混煎液的制备

混煎液的制备：取栀子、连翘各30g粉末，混合，加入600ml蒸馏水加热回流60分钟，取滤液用蒸馏水补足至600ml，得100mg生药/ml，得栀子与连翘的混煎液。共准备50份样本，8份用于模型的建立及标志物的寻找，另外42份用于模型的验证。

单煎混合液的制备：取栀子、连翘各60g粉末，各加入600ml蒸馏水加热回流60分钟，取滤液用蒸馏水补足至600ml，得100mg栀子生药/ml和100mg连翘生药/ml，并按照体积比1:1进行混合，得栀子与连翘的单煎混合液。共准备50份样本，8份用于模型的建立及标志物的寻找，另外42份用于模型的验证。

2、uplc-q-tof/ms分析及数据处理

色谱条件：液相为i-classuplc(waterscorp.,milford,ma,usa)；色谱柱为acquityuplcbehc18柱(2.1mm×100mm,1.7μm,waters)；柱温为40度；样品温度为4度；色谱条件以0.1％甲酸水(a)与乙腈(0.1％甲酸b)为流动相进行梯度洗脱：0-10min，5％-45％b，10-15min,45％-80％b；15-20min,80％-90％b；20-22min,90％-90％；22-23min,90％-5％b，平衡2min，流速为0.4ml/min。

质谱条件：masslynx4.1软件，watersxevog2-xs-q-tof，esi离子源，负离子模式，毛细管电压2.0kv，离子源温度为150度，脱溶剂温度为500度。锥孔电压30v，脱溶剂流速1000l/h，所有数据采集模式为centroid模式。亮氨酸-脑啡肽为参比液，以浓度为400ng/ml，流速为10μl/min注入质谱，[m-h]^-离子为554.2615与236.1035进行实时矫正质量轴。采用ms^e模式采集数据，在碰撞能量为6ev情况下，扫描时间为0.3s，间隔扫描时间为0.02s，锥孔电压为30v，质量扫描范围为m/z100-1200；在碰撞能量为30-70ev情况下，扫描时间为0.3s，间隔扫描时间为0.02s，锥孔电压为30v，质量扫描范围为m/z100-1200。

数据处理方法：质谱数据采用markerlynx4.1软件进行峰提取、峰对齐及归一化等处理，采用正交偏最小二乘判别分析法(pls-da)找到配伍合提液与合并液之间化学成分差异，并通过变量重要性投影(variabelimportantinprojection,vip)及阳性结果错误率(falsediscoveryrate，fdr)矫正的p值进行潜在化学标记物筛选，通过hmdb、metlin等数据库检索，对照品进一步比对，确认其标志物。

将混煎液、单煎混合液用甲醇稀释至10mg生药/ml^-1，过0.22μm膜，5μl注入色谱仪进行uplc-q-tof/ms分析，并按照上述数据处理方法对uplc-q-tof/ms结果进行分析。

三、试验结果

总离子流图见图1(其中a为混煎液，b为单煎混合液)。pls-da模型用于区分单煎混合液、混煎液的差异。2dpls-da图可区分两组的差异(如图2中a所示)，通过置换检验200次，r²＝0.597与q²＝-0.313，表明模型无过拟合(如图2中b所示)。r²y＝0.995与q²＝0.983，表明模型较稳定且具有较好的预测性。通过fdr矫正的p值及vip分析，对照品及数据库比对，得出12个差异化学标志物，即：白桦脂酸、齐墩果酸/熊果酸、连翘苷、胡萝卜甾醇、mussaenosidicacid、新绿原酸、藏红花酸、西红花苷i、西红花苷ii、6’-o-trans-sinapoylgeniposide、13-反式-西红花苷i、异槲皮苷为单煎混合液和混煎液差异标志物；且白桦脂酸、齐墩果酸/熊果酸、连翘苷、胡萝卜甾醇、mussaenosidicacid、新绿原酸在混煎液中含量升高，其余均降低。且白桦脂酸为vip值及fdr矫正的p值最显著的成分(如表1所示)。由此可见，白桦脂酸具有显著区分单煎混合液和混煎液的作用。

表1单煎混合液和混煎液差异标志物

通过剩余42份单煎混合液和42份混煎液样本验证白桦脂酸区分单煎混合液和混煎液的准确度：将84份样品分别进行uplc-q-tof/ms分析，以白桦脂酸离子强度峰面积148530为阈值(用常规的roc曲线法对上述16份用于模型建立及标志物寻找的样品结果进行处理得到)，高于该阈值的预测为混煎液，低于该阈值的预测为单煎混合液，结果准确度为100％。

综上，本发明发现白桦脂酸在栀子-连翘药对的单煎混合液和混煎液中存在显著差异，可以用作区分栀子-连翘药对单煎混合或混煎的标志物。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。