可溶性VSIG4作为生物标志物在制备噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于体外诊断标志物，可溶性vsig4作为生物标志物在制备噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断试剂盒中的应用。

背景技术：

噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocyticlymphohistiocytosis，hlh)，又称噬血细胞综合征(hemophagocyticsyndrome，hps)，被认为是一种单核巨噬系统反应性增生的组织细胞病。hlh分为原发性和继发性两大类，原发性hlh主要因为细胞毒性颗粒的生成和释放障碍，导致单核巨噬细胞活化；继发性hlh主要发生于感染或者肿瘤患者中，由于细胞毒性t细胞或nk细胞功能缺陷导致抗原清除障碍，单核巨噬系统接受持续抗原刺激过度活化增殖，激活细胞因子的级联瀑布效应，产生细胞因子风暴，导致巨噬细胞大量活化浸润吞噬血细胞和组织破坏并进而引发多器官功能衰竭。hlh主要表现为发热、脾大、全血细胞减少、高甘油三酯、低纤维蛋白原、高血清铁蛋白、高血清可溶性白介素-2受体α(scd25)，外周血nk细胞活性降低，可在骨髓涂片、脾脏或淋巴结活检中发现噬血细胞现象。由于继发性hlh缺乏标准的治疗方案，并且病情进展快，死亡率极高，因此高效的早期诊断对于hlh的治疗就显得尤为重要。

hlh-2004诊断标准中提出继发性hlh有八条诊断标准：1)发热；2)脾大；3)全血细胞中至少两系减少；4)高甘油三酯或低纤维蛋白原；5)高血清铁蛋白；6)血清可溶性白介素-2受体α(scd25)增高；7)外周血nk细胞活性降低；8)骨髓涂片、脾脏或淋巴结活检中发现噬血细胞现象。八条标准中满足五条即可诊断hlh，但是在临床实际工作中，不是每个医疗中心都开展针对这八条标准的检测方法。因此，找寻出新的特异标志物，对于hlh的诊治具有非常重要的意义。

本课题组前期发现可溶性vsig4在hlh病人血清中异常高表达，并与患者的预后和转归密切相关，进一步认为其可能对hlh有诊断价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供可溶性vsig4作为生物标志物在制备hlh诊断试剂盒中的应用。为实现该目的，本发明公开以下技术方案：可溶性vsig4作为生物标志物在制备hlh诊断试剂盒中的应用。

所述的诊断试剂盒包括但不限于，血清样本hlh诊断试剂盒、vsig4浓度检测试剂盒、crig浓度检测试剂盒、z39ig浓度检测试剂盒、巨噬细胞活化诊断试剂盒。

本发明的优点在于：本发明所述的可溶性vsig4，血清学检测结果表明在hlh患者中其表达显著高于正常人群，因此可以准确识别出hlh患者。通过诊断性研究分析发现可溶性vsig4的表达水平用于诊断hlh具有较高的敏感性、特异性和较大的曲线下面积(＞0.94)，结果稳定，诊断价值高，尤其对淋巴瘤/白血病合并的hlh诊断具有良好的特异性。

附图说明

图1可溶性vsig4在正常人群、乳腺癌、肺癌、胃癌、不合并hlh的肿瘤患者和合并hlh的肿瘤患者血清中的表达检测结果显示，在合并hlh的患者血清中，可溶性vsig4表达显著高于其他各组(***p＜0.0001)。

图2血清可溶性vsig4用于诊断淋巴瘤合并hlh的roc曲线，曲线下面积为0.94。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：人外周血血清中可溶性vsig4的elisa检测

为了检测人血清中的可溶性vsig4，进行了如下的elisa检测方法，所述方法的具体步骤为：

1.包被：用ph9.0的碳酸盐缓冲液作为稀释液，将兔或小鼠或山羊抗人vsig4胞外段的抗体稀释为1μg/ml，按100μl/孔加入至在聚苯乙烯的96孔平底酶标板中，用保鲜膜封好，4℃冰箱中放置过夜。次日，弃去包被液，用300μl的pbst缓冲液洗板3次，每次3分钟。

2.封闭：每孔加入200μl的2％bsa-pbs缓冲液，室温封闭1h，然后用300μl的pbst缓冲液洗板3次，每次3分钟。

3.加样：按100μl/孔加入可疑hlh患者的血清(用pbst缓冲液1∶10稀释)或梯度稀释的重组人vsig4蛋白，37℃孵育1h，每个样品设置2个平行孔。孵育结束后，弃去抗原，用350μlpbst缓冲液浸泡式洗板，3min×3次。

4.加酶标检测抗体：按100μl/孔加入用pbst缓冲液稀释的1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的兔抗人vsig4抗体作为检测抗体，室温孵育1h。而后弃去，用300μl的pbst缓冲液洗板3次，每次3分钟。

5.显色：提前15分钟将显色a液、显色b液(义翘公司tmbsubstratesolutionset)等体积混合，避光。然后按200μl/孔加入至酶标板中，避光，孵育20分钟。

6.终止：待颜色稳定后，每孔加入50μl2mh2so4溶液终止反应，并轻轻混匀至显色均匀。

7.读值：20分钟内将酶标板置于酶标仪中，读取450nm的光吸收值。

8.结果处理：首先确定2个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读数。对于每一例血清样品或标准品，计算孔间变异(孔间变异＝两孔od值之差/两孔od值之和)，如果该变异值(cv)＜15％，该样品为有效样品，否则，舍弃该例样品。取有效样品的两孔平均值作为该样品的od值，然后减去本底读数作为有效的od值。然后利用梯度稀释的重组vsig4标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例血清可溶性vsig4的蛋白浓度。注：上述实验方法所用材料，除特殊注明以外，均为分析纯试剂。

实施例2：人血清可溶性vsig4间接双夹心elisa检测方法的临床检测应用

利用实施例1的上述方法，对确诊hlh的淋巴瘤患者(平均年龄58岁，最大年龄84岁，最小年龄26岁)和不合并hlh的淋巴瘤患者(平均年龄46岁，最大年龄83岁，最小年龄10岁)的血清可溶性vsig4浓度进行了测定。试验结果和标准曲线显示血清可溶性vsig4浓度和淋巴瘤合并hlh两者之间的线性相关系数为0.9995，表明这一浓度梯度基本落在检测反应的线性范围内。实验结果发现，不合并hlh淋巴瘤患者的血清可溶性vsig4的平均浓度为676.5pg/ml，检测区间为0～3258pg/ml，合并hlh淋巴瘤患者的血清可溶性vsig4平均浓度是5569pg/ml，检测区间为1037～13017pg/ml。经过one-wayanova检验，两者差异具有显著性(p＜0.0001)。同时，健康对照组的血清可溶性vsig4的平均浓度为3.5pg/ml，检测区间为0～173pg/ml。

实施例2：采用对照方法进行的hlh平行检测

利用电化学发光方法(临床上常规使用的方法)测定了前述实施例2的所有elisa样品的血清可溶性cd25浓度，绘制可溶性cd25和可溶性vsig4用于hlh检测的受试者曲线(roc曲线)(图2)，结果发现，可溶性cd25的曲线下面积为0.92，可溶性vsig4的曲线下面积为0.94，这两个蛋白的诊断价值基本相同(delong非参数检验，p＝0.6125)。此时，获得最佳诊断效果的血清可溶性cd25阈值是8033u/ml，敏感性为95.00％，特异性为84.09％。可溶性vsig4阈值是2195pg/ml，敏感性为95％，特异性为86.36％。

上述结果表明，所建立的血清可溶性vsig4的elisa检测方法具有重复性好、敏感性高的特点。将其用于120例健康成人和hlh患者的血清可溶性vsig4测定发现，这一指标具有很高的检测敏感性，表明它可能是一个很有潜力的血清早期筛查指标。而且，其与可溶性cd25的诊断效力基本相同，具体而言，单独使用可溶性vsig4可以独立对hlh进行检测，其与目前临床常用的可溶性cd25具有近似的诊断价值。

实施例3：检测可溶性vsig4的hlh检测试剂盒

本发明还提供了一种hlh检测试剂盒，其中含有重组的人可溶性vsig4作为蛋白标准，含有抗人可溶性vsig4抗体(包被抗体：工作浓度2μg/ml，稀释缓冲液为50mm碳酸盐缓冲液，ph9.0；检测抗体：工作浓度1μg/ml，稀释缓冲液为150mm的pbst缓冲液，ph7.4)，以及实施例1中其它的检测试剂。

使用本发明的试剂盒采用实施例1的方法已完成临床试验64例，阳性预测值为76％，阴性预测值为97.44％，敏感性95％，特异性86.36％。根据文献检索，目前国内外尚无相同工作的报道。