一种小麦粉及其制品中间苯二酚的高效液相色谱测定方法与流程

本发明属于涉及一种小麦粉及其制品中间苯二酚的高效液相色谱测定方法，属于食品检测技术领域。

背景技术：

间苯二酚（英文名resorcinol）是一种重要的化工原料，也是实验室中一种常用试剂，已被证实为内分泌干扰物，长期接触，可导致皮炎、黏膜炎、惊厥和发绀等健康危害。因此，在医药和化妆品产品中有着严格的使用限量。在食品领域，我国国家标准gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》把其列为允许使用的食品用合成香料，在各类食品中按生产需要适量使用。但依据原食药总局关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告（2017年第132号），小麦粉中禁止添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫脲、间苯二酚等非食品原料。因此，加强小麦粉中间苯二酚的使用监管尤为重要。目前，小麦粉及其制品中间苯二酚的检测尚无方法标准，也无文献报道，不仅导致小麦粉及其制品生产企业在原料进货查验、出厂检验等环节缺少可靠的检验方法，还严重影响食品药品监管部门对小麦粉及其制品生产企业的日常监督检查与风险监测。综上，研究建立小麦粉及其制品中间苯二酚的检测方法意义重大。

目前，已报道的测定间苯二酚的方法有分光光度法、电化学法、同步荧光法、气相色谱法、离子色谱法和液相色谱法等。

技术实现要素：

本研究建立一种小麦粉及其制品中间苯二酚含量的高效液相色谱测定方法，方法采用紫外检测器和荧光检测器串联检测，有效避免了单一检测器定性手段单一的问题，增强了定性定量可靠性。方法操作简单、灵敏度高、选择性好、检出限低，非常适用于小麦粉及其制品中痕量间苯二酚的定性、定量检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种小麦粉及其制品中间苯二酚的高效液相色谱测定方法，采用以下步骤：

（1）前处理：称取小麦粉或其制品样品，加入甲醇涡旋混匀，超声，加入亚铁氰化钾和乙酸锌，用甲醇定容至刻度，离心，取上清液过有机相滤膜，待上机；

（2）标准溶液的配制：准确称取10mg间苯二酚标准品于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1mg/ml的标准储备液，工作标准溶液用甲醇逐级稀释；

（3）获得液相色谱图、回归方程：取步骤（2）中的系列标准工作溶液上机测定，得到标准溶液色谱图，以标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

（4）样品分析：用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器和串联荧光检测器对样品进行分析检测。

本发明所述的测定方法，前处理的步骤为：称取5g样品于25ml比色管中，加入15ml甲醇涡旋混匀，超声15min,加入1ml92g/l亚铁氰化钾和1ml183g/l乙酸锌，用甲醇定容至刻度，摇匀，于7000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机相滤膜，待上机。

本发明所述的测定方法，高效液相色谱仪的流动相为：甲醇/水、乙腈/水、甲醇/20mmol/l醋酸铵或乙腈/20mmol/l醋酸铵。

本发明所述的测定方法，高效液相色谱仪型号：waters2695或thermoultimate；色谱柱：c18-amide柱长150mm，柱内径4.6mm，填料内径3μm，流动相：a为水，b为甲醇。

优选地，流动相：a为水，b为甲醇，梯度洗脱的条件为：柱温：40℃；进样体积：10μl；流速：0.7ml/min；

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，二极管阵列检测器检测波长273nm，荧光检测器激发波长273nm，发射波长304nm。

有益效果

本方法建立了高效液相色谱-紫外-荧光串联法测定小麦粉中间苯二酚的含量，结果表明该方法操作简单、线性良好、准确度高，两种检测器串联使用，增加了定性定量的准确性。该方法应用，给小麦粉及其制品的监管和风险监测提供有效的技术支持，也为今后小麦粉及其制品加工过程中间苯二酚含量变化趋势研究打下基础。

附图说明

图1为不同色谱柱的峰形比较；

图2为间苯二酚在190-750nm波长范围内的光谱图；

图3为激发波长273nm时的发射波长扫描图；

图4为pda检测器谱图；a：标准物质谱图；b：样品谱图；c：样品加标谱图；

图5为荧光检测器谱；a：标准物质谱图；b：样品谱图；c：样品加标谱图；

图6为苯二酚三种同分异构体的分离色谱图；

图7为提取剂中甲醇的比例与目标物回收率的关系图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1.材料与方法

1.1材料与试剂

间苯二酚标准品：dr.ehrenstorfer；（c6h6o2，cas号：108-46-3，相对分子量110.00）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

甲醇(色谱纯)：merck；

亚铁氰化钾，乙酸锌（优级纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；

有机相微孔滤膜（0.22μm，上海安谱）；

实验室用水符合gb/t6682规定的一级水要求。

小麦粉、馒头、油条、面条、裹粉样品：市售。

亚铁氰化钾溶液(92g/l)：称取106g亚铁氰化钾,加入适量水溶解，用水定容1000ml。

乙酸锌溶液（183g/l）:称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30ml冰醋酸，用水定容至1000ml。

1.2仪器与设备：

高效液相色谱仪配二极管阵列检测器和荧光检测器：waters2695-pda-fld或thermoultimate-dad-fld；超声清洗仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平：梅特勒ms303s；离心机：sigma3-18k。

1.3标准溶液配制：

准确称取10mg间苯二酚标准品于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1mg/ml的标准储备液，工作溶液用甲醇逐级稀释。

标准中间液：准确移取1.00ml间苯二酚标准储备液于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备浓度为100µg/ml的标准中间液，于4℃避光保存，有效期6个月。

标准工作溶液：吸取间苯二酚标准中间液，用甲醇逐级稀释成浓度分别为0.01、0.02、0.1、0.5、1、5、10µg/ml标准工作溶液。临用前配制。

1.4样品前处理

称取5g(精确至0.01g)样品于25ml比色管中，加入15ml甲醇涡旋混匀，超声15min,加入1ml亚铁氰化钾（0.25mol/l）和1ml乙酸锌（1mol/l）,用甲醇定容至刻度，摇匀。于7000r/min离心3min，取上清液过0.22μm有机相滤膜，待上机。

1.5仪器条件：

色谱柱：c18-amide(3μm,150×4.6mm)；流动相：a为水，b为甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：40℃；进样体积：10μl；二极管阵列检测器（pda）串联荧光检测器，pda检测器检测波长273nm，荧光检测器激发波长273nm，发射波长304nm。

表1梯度洗脱程序

2.结果与讨论

2..1试验条件优化

2.1.1色谱柱及流动相的选择

文献报道中，间苯二酚的分离测定多使用c18柱。实验发现，间苯二酚在常规c18柱上出现峰拖尾现象，导致分离度降低、灵敏度减弱，精密度变差，从而影响定量结果的准确性。通过比较发现，c18-amide柱能有效解决间苯二酚的拖尾问题。比较了c18柱和c18-amide柱的峰形（图1），在测试液浓度为10μg/ml时，c18柱色谱峰拖尾因子为1.768，而c18-amide的拖尾因子为1.082，拖尾因子明显降低，峰形对称良好。这是因为c18-amide柱是一种复合作用模式的色谱柱，在c18疏水作用的基础上，键合的酰胺基可以增加极性化合物的保留并提供替代选择性，从而改善了含酚羟基等极性基团的化合物的保留。实验最终选择c18-amide为间苯二酚的分离色谱柱。实验还考察了不同流动相条件对间苯二酚的保留行为的影响。分别以甲醇/水、乙腈/水、甲醇/醋酸铵（20mmol/l）、乙腈/醋酸铵（20mmol/l）为流动相，考察间苯二酚的保留及分离情况。结果表明，几种流动相条件下峰形和保留均无明显差别。从经济角度及操作实用性等方面考虑，选择甲醇/水作为流动相。

2.1.2检测波长的选择

采用pda检测器，提取间苯二酚保留时间处的光谱图（图2），由图2可以看出，目标物在196.7和273.4nm处有最大吸收和特征吸收。由于196.7nm波长较短，干扰较多，故选择273nm为pda检测器的检测波长以及荧光检测器的激发波长。固定激发波长，对发射波长进行扫描，发现在304.7nm处荧光响应最强（图3），因此确定荧光检测器激发波长λex为273nm,发射波长λem为304nm。

2.1.3前处理条件的优化

间苯二酚易溶于水、甲醇、乙醚等溶剂。小麦粉及其制品多为高淀粉基质，若直接以水为提取剂，样品的分散性较差，回收率较低。实验分别以不同比例的甲醇/水为提取剂，比较不同提取剂的提取回收率，由图7可知，间苯二酚的回收率随甲醇浓度增高而增高，当甲醇比例到达80%后，回收率数值趋于稳定。由于馒头、面条等小麦粉制品吸水性较强，从精准定量的角度，选择纯甲醇为最优的样品提取剂。

实验考察了前处理沉淀剂对目标物回收率及净化效果的影响。结果发现，加与不加亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀剂对回收率及色谱峰均无明显差异。但是不经沉淀处理的样品溶液，在冷藏或长时间放置后会析出沉淀物，不利于批量样品的同时测定。而经沉淀处理的样品溶液不因放置时间的长短而出现沉淀物。因此，批量测定时，在不能保证立即上机的情况下，加入沉淀剂可保证溶液在冷藏条件下较长的时间保持澄清透明。

2.2方法确证

2.2.1方法的线性和检出限

将间苯二酚标准储备液用甲醇逐级稀释至0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1、5、10ug/ml，并依次注入液相色谱仪，以峰面积和测试液浓度做曲线。结果表明两种检测器在各自的线性范围内线性良好，且荧光检测器的灵敏度更高。两种检测器的线性范围、相关系数和定量限见表2。按取样量5g，定容为25ml，荧光检测器定量时，小麦粉及其制品中间苯二酚的检出限为0.02mg/kg、定量限为0.05mg/kg。

表2两种检测器的线性范围、相关系数检出限及定量限

2.2.2方法的准确性与精密度

选取小麦粉及其制品（自发粉、鲜面条、干面条、馒头、裹粉和油条），分别加入一定量的间苯二酚标准溶液，加标水平分别为方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限，每个水平平行测定6次，考察方法的回收率及精密度。结果表明，不同样品的回收率均在83-108.6%范围内，相对标准偏差均小于15%。结果见表3。

表3不同样品添加回收率

2.2.2方法的特异性

为考察方法的特异性，对空白样品和加标样品按照相同的前处理和仪器条件进行分析，得到的谱图（图4、5）表明，在间苯二酚保留时间处没有明显的干扰峰。实验还考察了间苯二酚两种同分异构体邻苯二酚和对苯二酚对目标物的干扰情况，发现在本方法建立的流动相条件下，三种同分异构体能有效分离，其分离色谱图见图6。综上，方法的特异性较强，有效避免了复杂基质中假阳性的影响。

2.2.4方法的应用

对市售小麦粉、面条、馒头等样品共计50批次，按本方法建立的前处理方法进行处理与上机测定，未发现间苯二酚阳性样品。

3.结论

本方法建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器-荧光检测器串联法测定小麦粉中间苯二酚的含量，结果表明该方法操作简单、线性良好、准确度高，两种检测器串联使用，增加了定性定量的准确性。该方法应用，给小麦粉及其制品的监管和风险监测提供有效的技术支持，也为今后小麦粉及其制品加工过程中间苯二酚含量变化趋势研究打下基础。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。