一种大西洋鲑和虹鳟的质谱鉴别方法与流程

本发明涉及一种蛋白质质谱检测方法，尤其涉及一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法。

背景技术：

海产品的真假和来源评估是食品评估鉴定中重要的组成部分。许多鱼类食品被标上错误标签，甚至有劣质鱼肉、假冒鱼肉被贴上优质鱼肉的标签，这严重影响了市场透明度，损害了消费者的健康。日前，中国水产流通与加工协会和三文鱼分会成员单位共同通过三文鱼的鉴定标准，将三文鱼定为鲑科鱼类的统称，大西洋鲑和虹鳟同为三文鱼的一种。这引发了业界的广泛关注和消费者的质疑。

虽然大西洋鲑和虹鳟同属鲑科鱼类，但大西洋鲑是国际上流行的名贵食用鱼类，其含有2.7％的ω-3脂肪酸(epa、dpa和dha)，能有效的降低人体的胆固醇含量，从而预防心血管疾病的发生。大西洋鲑体内更富含抗氧化物质虾青素，虾青素在高温下极易氧化，只有生食才能保证大西洋鲑中的虾青素不被破坏，因此生食大西洋鲑一直是消费者热爱的食用方法。大西洋鲑多依赖进口，价格高昂，并且其肉色难辨，因此，国内市场上出现了以淡水虹鳟鱼冒充大西洋鲑的现象。许多消费者所认为的三文鱼是大西洋鲑这类的海水鱼而不是虹鳟这类的淡水鱼。虽然海水鱼和淡水鱼普遍都会携带有寄生虫，但其区别在于渗透压等因素。海水的渗透压高，与人类体内环境不同，因此海水鱼所携带的寄生虫多数情况下无法在人体内长时间存活及利用人体来完成生命周期。只要处理得当，生食海水鱼感染寄生虫的风险相对较低。而淡水鱼携带寄生虫成长环境与人体内环境类似，它们能在人体内长时间寄存且危害较大。我国内市场内大约有三分之一的“三文鱼”实际产自青藏高原等内陆淡水湖。商家为降低成本，以次充好，用国产虹鳟鱼冒充大西洋鲑的行为严重危害了消费着的健康。而此次中国水产协会将大西洋鲑和淡水虹鳟同定义为“三文鱼”的行为再次将三文鱼的鉴别引入公众视线。

大西洋鲑和虹鳟鱼因为颜色和纹理较为相似，人类肉眼难以分辨。如何能确保消费者购买到的贵价三文鱼确实是大西洋鲑呢。目前，三文鱼的鉴别技术有近红外光谱技术和pcr-rflp、aflp、dna条形码、荧光实时定量pcr等分子生物技术。pcr-rflp和aflp所用试剂对人体有害切操作步骤极为繁琐，用时较长。而荧光实时定量pcr鉴别物种虽然快速准确，但是成本较高。随着三文鱼销量的走高，进口三文鱼(大西洋鲑)的缺口进一步加大，利用虹鳟等淡水鱼冒充三文鱼的行为也逐渐增多。为保证消费者的知情权和身体健康，有必要一种新型的基于蛋白质组学的质谱检测方法，确定大西洋鲑和虹鳟的特征肽段，建立多反应监测方法进行定性和定量分析。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，灵敏度高，准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑掺假的确证和检测。

本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；b)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤a)和b)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定；c)通过基本局部比对搜索工具与uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤a)从蛋白质数据库uniport中下载获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列，所述步骤b)和c)通过质谱结果结合分析软件确定多肽片段混合物中是否存在大西洋鲑和虹鳟的特征肽段。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤b)利用胰蛋白酶进行酶解，酶解后的样品在hplc-q/orbitrap上以数据依赖采集方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证；所述步骤d)针对每个特征肽选择5-6个离子对进行多肽混合物的多反应监测，完成蛋白质定量检测。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤b)包括：b1)称取均质后的固体试样2g，加入2ml质量百分浓度0.1％的三氟乙酸溶液和8ml三氯甲烷溶液于50毫升离心管中，漩涡振荡器上涡旋震荡5min，进行氯仿脱脂，在4500r/min下离心3min，去除上清液，重复除脂2次，于室温减压浓缩至近干；b2)在样品中加入10ml摩尔浓度为50mmol/l三羟甲基氨基甲烷-酸盐溶液，调节控制ph值为7.2，漩涡振荡器上涡旋涡旋震荡1min，60℃水浴震荡提取1h，在10000r/min下离心5min，收集上清液备用；b3)移取200μl上述提取液于1.5ml低蛋白吸附的离心管中，加入150μl500mmol/l碳酸氢铵溶液，10μl摩尔浓度为500mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后置75℃恒温水浴锅中孵育30min；b4)冷却至室温后，加入30μl500mmol/l碘代乙酰胺溶液，避光反应30min；b5)加入10μl摩尔浓度为100mmol/l氯化钙溶液和50μl牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴中过夜酶解；b6)加入10μl甲酸混匀，终止反应。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤d)蛋白质定量检测包括：选取不同类型、柱长或内径的色谱柱，记录色谱分离的变化；调节流动相流速、梯度或时间参数，记录分离效率的变化；控制柱温和试液温度，针对大西洋鲑和虹鳟的特征肽记录色谱保留时间的重现性；调节喷针位置、毛细管电压、锥孔电压、各路气体流量和温度以及碰撞能参数；采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，还包括收集各种不同产地的大西洋鲑和虹鳟进行蛋白质特征肽定性确证和定量检测，并收集不同来源的样品，获取统计结果。

上述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其中，所述步骤c)中若检测出特征肽段gglgsagptgpr、geiggvgangpsgpqggr、igsglvqeaaplvdk或gdpgpggpqgepgavgpagitgdk，则定性判断混合物中存在大西洋鲑；所述步骤c)中若检测出特征肽段gdpgpggpqgeqgvvgpagisgdk，则定性判断混合物中存在虹鳟特征肽段。

本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，能够定性确定大西洋鲑和虹鳟的特征肽段，并建立了大西洋鲑和虹鳟同时定性鉴定和精确测量的mrm方法，灵敏度高，检测限为1％；准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑掺假的确证和检测。

附图说明

图1为本发明大西洋鲑和虹鳟特征肽段的质谱检测流程示意图；

图2为本发明大西洋鲑特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图；

图3为本发明虹鳟定特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

图1为本发明大西洋鲑和虹鳟特征肽段的质谱检测流程示意图。

请参见图1，本发明采用的检测方法主要为液相色谱-质谱联用法，质谱联用电喷雾电离(esi)是迄今为止最可靠的多肽检测技术。本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：

s1)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存；

s2)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤s1)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定；

s3)通过基本局部对比搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool，blast)与uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；

s4)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。本发明首先用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，将得到的一系列多肽分子量或碎片离子的数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白质，实现蛋白质的鉴定，即肽质量指纹图谱法(peptidemassfingerprint，pmf)或肽段碎片离子鉴定法(peptidefragmentsidentification，pfi)。然后根据检测结果结合相关蛋白质组学软件挑选出符合要求的特征肽段，建立多反应监测(mrm)方法进行定量分析。

胰蛋白酶的酶切位点为k和r，将大西洋鲑和虹鳟用胰蛋白酶酶解后，将会得到gglgsagptgpr、geiggvgangpsgpqggr、igsglvqeaaplvdk、gdpgpggpqgepgavgpagitgdk四个大西洋鲑特征肽段和gdpgpggpqgeqgvvgpagisgdk一个虹鳟特征肽段，总共五个特征肽段，这五个特征肽段具有不同的分子量，因而可以通过质谱方法检测，可分别用于确定大西洋鲑和虹鳟。

本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，结合高效液相色谱-串联四级杆质谱(qqq)系统，及skyline软件，建立mrm方法，可同时实现大西洋鲑和虹鳟的定性鉴定和定量研究。特征肽段的确定和mrm方法的具体建立过程如下：

(1)从uniport数据库中下载大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列，对大西洋鲑和虹鳟酶解产生的多肽混合物进行扫描，利用proteinpilot搜索软件进行蛋白质的确证，确定其产物碎片的氨基酸序列。

(2)利用skyline软件结合质谱检测结果，根据特征肽的选择原则，确定大西洋鲑和虹鳟的特征肽段，针对每个特征肽选择响应最高的5-6个离子对，用于建立多肽混合物的mrm方法，如下表所示(*代表定量离子)，其余子离子用于辅助定性分析。

本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，建立大西洋鲑和虹鳟同时检测的色谱质谱方法。

(1)优化hplc条件：考察色谱柱参数包括类型、柱长、内径等对色谱分离的影响；优化流动相流速、梯度、时间等参数对分离效率的影响；选择合适的柱温和试液温度；针对大西洋鲑特征肽段和虹鳟特征肽段考察其色谱保留时间的重现性。

(2)优化esi-qqq条件：优化喷针位置、毛细管电压，锥孔电压，各路气体流量和温度以及碰撞能参数；采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。

(3)收集各种产地的大西洋鲑和虹鳟，采用优化后的前处理和色谱质谱方法，进行大西洋鲑特征肽段和虹鳟特征肽段的定性确证和定量检测工作；并收集不同来源样品的定性定量数据，获得统计结果。考察方法的线性范围、灵敏度、重现性、回收率等指标。

本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，具体酶解过程如下：

1)称取均质后的固体试样2g，加入2ml0.1％的三氟乙酸溶液和8ml三氯甲烷溶液于50毫升离心管中，漩涡振荡器上涡旋震荡5min，进行氯仿脱脂，4500r/min下离心3min，去除上清液，重复除脂2次，于室温减压浓缩至近干。

2)样品中加入10ml摩尔浓度为50mmol/l三羟甲基氨基甲烷-酸盐溶液(ph＝7.2)，漩涡振荡器上涡旋涡旋震荡1min，60℃水浴震荡提取1h，10000r/min下离心5min，收集上清液备用。

3)准确移取200μl上述提取液于1.5ml低蛋白吸附的离心管中，加入150μl500mmol/l碳酸氢铵溶液，10μl摩尔浓度为500mmol/l二硫苏糖醇溶液，混匀后置75℃恒温水浴锅中孵育30min。

4)冷却至室温后，加入30μl摩尔浓度为500mmol/l碘代乙酰胺溶液，避光反应30min；。

5)加入10μl100mmol/l氯化钙溶液和50μl牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴中过夜酶解。

6)加入10μl甲酸混匀，终止反应

7)酶解后的样品在hplc-q/orbitrap上以数据依赖采集(data-dependentacquisition，dda)方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证。

8)酶解后的样品在hplc-qqq上以mrm方式进行蛋白质定量检测。

综上所述，本发明提供的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，灵敏度高，将该方法用于大西洋鲑中虹鳟鱼的掺假检测，最低检出限可达1％。准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑掺假的确证和检测；大西洋鲑特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图如图2所示，虹鳟特征肽段定量离子对和定性离子对的色谱质谱图如图3所示，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为质谱强度。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。