一种植物抗寒性高效活体鉴定方法与流程

本发明涉及一种植物抗寒性鉴定方法，尤其涉及一种植物抗寒性高效活体鉴定方法。

背景技术：

油梨(perseaamericanamill.)是樟科鳄梨属一种速生常绿乔木果树，又名鳄梨、酪梨，俗称牛油果。油梨起源于中美洲、墨西哥热带湿润地区及海拔较高的山地森林或热带高原，是著名的热带亚热带果树。油梨于1918年引种到中国，如今已分布在海南、广东、广西、贵州、云南、台湾等热带、南亚热带地区。低温是果树栽培的重要限制因子，油梨在桂北地区、贵州亚热带高海拔地区等地常因冬季低温而遭受严重寒害，轻则枝叶受害，重则整株死亡，严重影响了中国油梨产业的安全发展。因此对油梨种质资源的抗寒性强弱及耐受低温范围进行研究鉴定，对指导油梨区域化栽培、抗寒性品种选育及抗寒性机理的深入探讨具有重的理论意义和实践价值。

电导法是一种经典的植物组织抗寒性鉴定方法，因其简便、灵敏而被广泛应用。在此基础上，测定不同温度下植物组织的“导法线”，配以logistic方程求拐点温度可测算出植物组织的低温半致死温度(lt50)，以作为植物抗寒性的数量指标。近年来，电导法已在苹果、葡萄、洋梨、莲雾、果梅、李、柑橘、杨桃等果树抗寒性研究鉴定中广泛应用，但用电导法结合logistic方程测定油梨的半致死温度及抗寒性评价尚未见报道。

电导法或lt50鉴定法虽准确、实用，但其测定需模拟低温胁迫过程，需对植物组织进行剪切，是一种破坏性鉴定，故有必要探索一种活体鉴定方法，以准确、高效、非破坏性鉴定油梨资源的抗寒性强弱。

电容是表征电容器容纳电荷本领的物理量，其值的大小与介电常数、测定面积、两极距离有关，可用电容测试仪直接测定。在既定电容测试仪的测定面积、两极距离一定的条件下，电容值的大小就只与观测样本的介电常数有关。对既定样本，用既定电容测试仪所测定的电容值理论上应为一固定值，这就为通过既定电容测试仪观测电容值来推断样本差异提供了可能。但以我们所掌握的资料所知，目前尚未有通过测定电容值大小来推断植物样本间差异的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种田间测定活体成熟叶片相同部位电容值作为判断其抗寒性强弱的新方法，在常温条件下即可进行，简便、快捷，且不破坏性检测物。

本发明是这样实现的：

一种植物抗寒性高效活体鉴定方法，包括以下步骤：(1)利用电容测试仪测定植物成熟叶片的适宜部位的电容；(2)比较植物不同品种成熟叶片上相同部位的电容大小，电容越小，则该品种抗寒性越强。

其中，成熟叶片是指叶片性状、大小不再发生变化，且叶色已转变成该植物应有的色泽。

优选地，所述适宜部位为叶片基部主脉、叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉、叶中部侧脉、叶尖部侧脉、叶基部叶肉、叶中部叶肉、叶尖部叶肉中的一处或多处。

优选地，所述适宜部位为叶片叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉、叶基部主脉、叶中部侧脉、叶基部叶肉和叶中部叶肉中的一处或多处。

优选地，所述适宜部位为叶片叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉中的一处或多处。

在具体实施方式中，以海南大学热带农林学院儋州校区油梨种质资源圃的38份油梨种质资源为材料，通过电导法结合logistic方程测算各油梨资源的半致死温度，同时田间活体测定其中27份油梨资源叶片不同部位的电容值，对叶片各部位电容值与半致死温度lt50进行相关性分析，以推断叶片电容测定法是否可用作油梨资源抗寒性强弱的鉴定。其后，田间测定台农1号和冬芒两个抗寒性差异较大的芒果品种叶片的电容值，以进一步验证电容法鉴定植物抗寒性强弱的可靠性。结果表明，(1)所测38份油梨种质抗寒性差异较大，半致死温度介于-5.056℃～3.045℃之间，其中14号种质半致死温度为3.045℃，抗寒性最弱，21号品种半致死温度为-5.056℃，抗寒性最强；(2)27份油梨种质活体叶片相同部位电容差异较大，同一种质叶片叶脉的电容值较叶肉大，叶脉部位的电容值随着叶脉的变细而减小，叶片不同部位叶肉的电容值相近。(3)油梨各种质半致死温度与其叶片叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉这3个部位的电容值有显著的正相关性，与叶基部主脉、叶中部侧脉、叶基部叶肉和叶中部叶肉这4个部位的电容值的相关性已经达到92％以上，与叶尖部侧脉和叶尖部叶肉这2个部位的电容值的相关性也在80％左右，即油梨各种质抗寒性与油梨叶片各个部位电容呈负相关。(4)在芒果品种中的验证试验结果表明冬芒(抗寒性较强)的叶片各部位电容值均低于台农一号(抗寒性较弱)，其中冬芒叶片叶基部主脉电容值1.1394nf显著低于台农一号2.0448nf，冬芒叶中部主脉电容值0.189nf极显著低于台农一号0.3764nf，冬芒叶尖部主脉电容值0.0065nf显著低于台农一号0.0105nf，与油梨抗寒性鉴定中得出的电容值与抗寒性成负相关的理论相符合。由此可见，在油梨和芒果品种的抗寒性研究中，田间测定活体成熟叶片相同部位电容值可作为判断其抗寒性强弱的新方法，这种方法可以在其它植物上应用。

本发明通过用电容测定仪田间测定植物成熟叶片的适宜部位电容值来鉴定、比较不同品种的抗寒性强弱关系，且本鉴定方法不需让植物样本经历低温胁迫过程，在常温条件下即可进行，具有简便、快捷、准确性较高、非破坏性检测之特点，是一种田间高效、快速测量植物抗寒性强弱的新方法。

附图说明

图1为电容测定仪田间测定油梨叶片的部位。

图2和图3为低温胁迫下不同油梨种质半致死温度分析结结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料取自海南大学儋州校区油梨种质资源圃，供试品种为38个油梨种质，每个种质选取三株长势良好的六年生成年树。采样时间为2017年12月-2018年1月，在每株树的东、南、西、北4个方位采取大小基本一致的当年生无病虫害完整成熟叶片18张，其中9张直接在树上活体测定电容值，另外9张用湿纱布包裹好放入自封袋中，带回实验室用于相对电导率的测定。

1.2试验方法

1.2.1低温胁迫的处理

将采集的38份油梨叶片用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗两次，滤纸擦干叶表后分别置于4℃、2℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃温度下暗处理12h，以室温(25℃)处理为对照(ck)。本文中种质用数字编号代替，各种质名详情请见附录1。

1.2.2相对电导率的测定方法

将处理好的材料取出放入保鲜盒中，然后把保鲜盒放入0℃的冰水混合物中(其中常温、4℃、2℃、0℃处理不用放冰水混合物中)解冻30min，后将叶片避开大叶脉剪成长宽约1cm的小碎片，每个品种每个温度处理的叶片混合称取6份0.5g的样品分别放入6个100ml的锥形瓶中(锥形瓶用洗洁精冲洗干净，再用蒸馏水冲洗两遍，烘干)，再往每个锥形瓶中加入25ml水，放入真空干燥箱中抽气30min，接着放入摇床震荡1h，取出静置15min，用便携式电导率仪(厂家：中国杭州齐威仪器有限公司，型号：ddb-11a)测电导率k1，称量每个锥形瓶的重量，做好记录，把锥形瓶放入沸水浴锅中水浴15min后取出冷却，加水至原来的重量。放入摇床震荡1h，取出静置10min，测k2。

相对电导率(％)＝k1/k2＊100％

1.2.3logistic方程的拟合及拐点温度的计算

参照朱根海等的的方法应用logistic方程确定植物组织低温半致死温度[2]，即通过对每个品种不同低温处理的电解质渗出率曲线用spss19进行回归分析，拟合logistic方程(y＝k/(1+a＊exp(-bx))，拐点温度的计算方法为：lt50＝(lna)/b。

1.2.4电容的测定方法

采用电容测定仪(中国品牌：mastech，型号：ms8910)测定叶片基部主脉、叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉、叶中部侧脉、叶尖部侧脉、叶基部叶肉、叶中部叶肉、叶尖部叶肉这9个部位电容，如图1所示。测定时把电容仪的测定金属片插入到叶片的待测部位即可测得这个部位的电容值。

1.3芒果抗寒性鉴定验证性试验设计

从中国海南省儋州市中国热带农业科学院品种资源研究所芒果种质资源圃选取冬芒和台农一号两个生产实践中抗寒性差异较大的芒果品种作为电容抗寒性鉴定验证性试验材料，其中，冬芒的抗寒性强于台农一号。试验时，每个芒果品种分别选取3棵八年生成年树，每个品种随机采10张当年生、大小基本一致、无病虫害的完整成熟叶片，田间就地分别测量叶片叶基部主脉、叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉、叶中部侧脉、叶尖部侧脉、叶基部叶肉、叶中部叶肉、叶尖部叶肉这九个部位的电容值。

2结果与分析

2.1低温胁迫下不同油梨种质叶片相对电导率分析

由表1可知，常温条件下，油梨叶片相对电导率均处于最低水平，但所试38份油梨种质间存在显著差异，其中30号种质油梨叶片电导率值仅有12.58％，显著低于其他种质，27号种质电导率则为最大值，比30号种质高出12.56％。经低温处理后，油梨叶片相对电导率均呈现出不同幅度增长，但各油梨种质在相同低温处理条件下，其叶片相对电导率增幅不同，其中，1号和14号种质油梨经4℃～-6℃处理后，其相对电导率分别只增加了37.35％、40.05％，而28号种质油梨经过4℃～-6℃处理后，其相对电导率增加了68.56％，43号油梨种质经2℃～-8℃处理后其相对电导率则增加了68.62％。由此可见，常温状态下，所试38份油梨种质间相对电导率存在显著差异，在同等胁迫条件下，电导率变化幅度也存在较大差异，即不同油梨种质叶片电导率对低温敏感程度不同，但常温条件下叶片电导率高低与其低温敏感程度无绝对关系。

表138份油梨种质叶片不同温度下的相对电导率

每个值均以平均值±标准误差(n＝6)表示。表列中相同字母表示不具有显著性p＜0.05(games-howell检验)。

2.2低温胁迫下不同油梨种质半致死温度分析

为方便数据分析，特将38份油梨种质的相对电导率曲线根据低温范畴分为两组作图分析(图2和图3)。从图2和图3可看出，常温条件下，38份油梨种质的相对电导率均随着处理温度的降低而呈现出相对升高的变化趋势，符合“导法线”变化特征，其中有17个种质拐点温度出现在2℃～-4℃之间(图2)，21个种质拐点温度出现在0℃～-6℃之间(图3)。

通过对该38份油梨种质的相对电导率曲线拟合logistic方程做回归分析所得结果如表2所示，14号品种的半致死温度最高，为3.045℃，21号品种的半致死温度最低，为-5.056℃，其它品种的半致死温度介于-5.056℃～0.854℃之间。根据半致死温度的高低可以判断出各品种的抗寒性强弱关系，半致死温度越低，抗寒性越强，由此可见，所试38份油梨种质中，21号品种的抗寒性最强，14品种的抗寒性最弱。

表2低温下38份油梨种质叶片的匹配方程和低温半致死温度

2.3不同温度下油梨种质电导率与半致死温度的相关性

根据38份油梨种质的半致死温度与不同温度下的相对电导率的pearson相关性分析可知(表3)，半致死温度(lt50)与4℃、2℃、0℃、-2℃和-4℃处理的相对电导率有极显著正相关性，与-6℃、-8℃和对照处理的相对电导率相关性不显著。从表1可看出，-4℃处理下，占82％的油梨种质的相对电导率在50％以上，而-6℃处理下，所有油梨种质的相对电导率都超过了50％，所以-4℃～-6℃胁迫处理算是相对电导率为50％的分界线。在相对电导率不超过50％的低温胁迫下，可以大致通过相对电导率的大小来判断抗寒性强弱，相对电导率越小，抗寒性越强。

表338份油梨种质叶片的半致死温度与不同温度下的相对电导率的pearson相关性分析

＊.显著性在0.05水平(两边)

＊＊.显著性在0.01水平(两边)

2.4油梨27份种质叶片电容值分布规律

如表4所示，不同油梨种质叶片相同部位电容值有较大差异，同一品种叶片不同部位电容值也存在较大差异。叶片基部主脉和中部主脉电容值均大于叶基部侧脉和叶中部侧脉，叶基部侧脉和叶中部侧脉电容值均大于叶肉。所测27份油梨种质，其中约92％种质叶基部主脉电容值显著大于叶中部主脉，约96％种质叶基部侧脉和叶中部侧脉电容值无显著差异，所有种质叶基部叶肉和叶中部叶肉电容值无显著差异，约63％种质叶尖部主脉与叶尖部侧脉与叶尖部叶肉电容值无显著差异。叶片基部、中部、尖部主脉电容值呈现显著降低趋势，叶片基部、中部侧脉电容值无显著差异，但显著高于叶尖部侧脉，约58％种质叶片基部、中部、尖部叶肉电容值也无显著差异。由此可见，油梨叶片不同部位组织电容值存在较大差异，在比较不同品种间电容值大小时，宜用相同部位组织电容值进行比较。

表4常温下27份油梨种质叶片的电容

每个值均以平均值±标准误差(n＝7)表示。表列中相同字母表示不具有显著性p＜0.05(games-howell检验)。

2.5油梨叶片不同部位电容值与半致死温度间的相关分析

通过对27个油梨种质的半致死温度与其对应品种叶片各部位电容做pearson相关性分析，结果如表5所示，各油梨种质的半致死温度与叶片叶中部主脉、叶尖部主脉、叶基部侧脉这三个部位电容值呈显著正相关性，其中与叶基部侧脉电容值的相关性达到了极显著水平。叶片其它部位电容值与半致死温度的相关性虽然还没达到0.05显著水平，但叶基部主脉、叶中部侧脉、叶基部叶肉和叶中部叶肉这四个部位的电容值与半致死温度的相关性已经达到92％以上，叶尖部侧脉和叶尖部叶肉这两个部位的电容值与半致死温度的相关性也在80％左右。由此可推断油梨种质的抗寒性与各种质叶片叶中部主脉、叶尖部主脉和叶基部侧脉这三个部位电容值呈显著负相关性，与叶片其它部位电容值也呈负相关性，即抗寒性越强，叶片组织电容值越小。

表527份油梨种质的半致死温度与其对应品种叶片各部位电容做pearson相关性分析

＊.显著性在0.05水平(两边)

＊＊.显著性在0.01水平(两边)

2.6抗寒性不同的芒果品种叶片电容值分析

冬芒和台农一号叶片各部位电容值如表6所示，冬芒所测叶片九个部位电容值均低于台农一号。表7方差分析显示，冬芒叶中部主脉电容值0.189nf极显著低于台农一号0.3764nf，冬芒叶基部主脉、与叶尖部主脉电容值则均显著低于台农一号，而冬芒的抗寒性强于台农一号，由此可知芒果叶片某些部位电容值与其抗寒性也呈负相关性，电容值大小也可以用于判定芒果叶片抗寒性强弱，这与电容值在油梨抗寒性鉴定上的研究推论相吻合。

表62份芒果种质叶片不同部位的电容

每个值均以平均值±标准误差(n＝10)表示。

表72份芒果种质叶片对应部位的方差分析

＊.显著性在0.05水平

＊＊.显著性在0.01水平

在本试验中，常温条件下，不同油梨种质叶片相同部位电容值存在较大差异，相同品种叶片不同部位其值也存在较大差异(表4)，叶中部主脉、叶尖部主脉和叶基部侧脉这三个部位电容值与lt50呈显著正相关性，其中叶基部侧脉电容与lt50的相关性达到了极显著水平(表5)，由此推断油梨种质的抗寒性与各种质叶片叶中部主脉、叶尖部主脉和叶中部侧脉这三个部位电容值呈显著负相关性，即抗寒性越强，叶片各部位电容越小。这一推论在两个抗寒性差异较大的芒果品种上的试验得到进一步验证：抗寒性较强的冬芒叶片各部位电容值均低于台农一号，其中冬芒叶片叶基部主脉、叶中部主脉和叶尖部主脉电容值均显著低于台农一号(表6、表7)，进一步验证电容法鉴定植物抗寒性强弱的可靠性。这种方法可以在其它植物(例如苹果、葡萄、洋梨、莲雾、果梅、李、柑橘、杨桃等)上应用。采用本实施例里的方法即可验证，本发明在此不一一例举。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。