本发明涉及neo-克罗烷型二萜类化合物应用领域，具体为neo-克罗烷型二萜类化合物对黑麦草的植物毒活性测试方法。
背景技术：
农田杂草是危害农田的重要生物因素之一,不仅与农作物争夺养料、水分、阳光和空间，妨碍田间通风透光，增加局部气候温度，有些还是病虫中间寄主，促使病虫害发生，从而降低作物的产量和品质。此外，有的杂草的种子或花粉含有毒素，能使人畜中毒。
杂草的防除方法主要有植物检疫、人工除草、机械除草、物理除草、生态除草、化学除草等。而化学除草具有高效、及时、省工、经济等特点，适应现代农业生产作业，还有利于促进免耕法和少耕法的应用、水稻直播栽培的实现以及密植程度与复种指数的合理的提高等。但长期大量使用化学物质对生态环境可导致不利影响。这就要求除草剂的品种和剂型向低剂量、低残留的方向发展，同时力求与其他措施有机地配合，进行综合防除，以减少施药次数与用药量。近年来，世界除草剂发展渐趋平稳，主要发展高效、低毒、广谱、低用量的品种，对环境污染小的一次性处理剂逐渐成为主流。从天然产物中寻找新的低毒、低污染、低用量、低残留的植物源除草剂已成为现代农药研究开发的一个热点领域。
技术实现要素：
针对上述问题和现有技术的不足，本发明提供了一种neo-克罗烷型二萜类化合物对黑麦草的植物毒活性测试方法，所述neo-克罗烷型二萜类化合物结构式如式(ⅰ)所示，
其特征在于：利用neo-克罗烷型二萜类化合物式(ⅰ)对黑麦草的植物毒活性的测试方法包括如下步骤：
s1、供试植物的培养：利用平板培养法，对黑麦草种子进行浸泡，清洗、萌发培养；
s2、测定化合物式(ⅰ)对四种植物的毒活性：选取大小相仿，萌发状态一致的黑麦草幼苗放入测试孔板中，后放入到培养箱中进行培养；取出幼苗测量根长和叶鞘的长度，并计算抑制率；
s3、选取阳性对照药物：选取草甘膦作为阳性对照药物，将草甘膦和化合物式(ⅰ)用dmso溶解，配置成特定浓度溶液，并以相同浓度的dmso水溶液作为空白对照；
s4、对比确定neo-克罗烷型二萜类化合物式(ⅰ)对黑麦草的植物毒活性的抑制率。
所述步骤s1中，黑麦草种子浸泡方式为：首先将种子在冷水中浸泡8小时，后用3％的次氯酸浸泡5分钟。
所述步骤s1中黑麦草种子清洗方式为：将黑麦草种子用无菌水清洗至无次氯酸味。
所述步骤s1中黑麦草种子培养方式为：放置在用无菌水湿润的含两层无菌滤纸的大培养皿中，在恒定温度为23℃的培养箱中进行萌发，培养时间为3天。
所述步骤s3中，黑麦草幼苗抑制率的计算公式：抑制率＝(对照组数据-处理组数据)/对照组数据*100％。
所述步骤s3中，dmso的浓度不超过1％
本发明的有益效果为：这种neo-克罗烷型二萜类式(ⅰ)化合物是从半枝莲中分离的具有特定生物活性功能的化学物质，兼有化学和生物学的两重性,既保留了先导化合物低毒、在环境中易分解的特点，又大幅度地提高了生物活性、降低了人工成本。含有本发明中化合物式(ⅰ)的除草剂对于环境及植物、人、动物等无不良影响，也不会污染环境。化合物式(ⅰ)对黑麦草有较强的抑制活性，可作为一种新型除草剂的先导化合物，为合成化学家提供模板分子，也为发展新型的，低毒的除草剂提供了新思路。
具体实施方式
一、neo-克罗烷型二萜类化合物式(ⅰ)的提取
将收集到的半枝莲地上部分阴干，得到干燥的地上部分10kg，将其粉碎，用重蒸的工业甲醇80l在室温下浸泡3次，每次浸泡7天，合并所有提取液，过滤后减压蒸馏除去溶剂，得到总浸膏(1kg)。将总浸膏溶解在热蒸馏水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩，得到两部分萃取物。将乙酸乙酯萃取物(200g)过大孔树脂，用甲醇-水(30:70，50:50，80:20，95:5,v:v)体系进行洗脱，得到4部分样品。第3部分80％甲水部分(50g)经mci柱乙醇-水(60:40，70:30，80:20，90:10,100:0v:v)体系进行洗脱，得五部分样品(a-e)。第二部分样品b(10g)经正相硅胶柱，石油醚-丙酮(10:1，8:1，5:1，3:1，1:1v:v)体系进行梯度洗脱，经薄层色谱检测合并相同段，得4部分样品(b1-b4)。b2(5g)经葡聚糖凝胶柱，二氯:甲醇1:1体系洗脱得3部分(b21-b23)，b22(200mg)经半制备高效液相纯化的化合物1(20mg)，b3经葡聚糖凝胶柱，正相硅胶柱二氯甲烷-乙酸乙酯(8:1,5:1,3:1,1:1,v:v)体系进行洗脱得化合物2(30mg)。第三部分样品c经正相硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯(10:1，8:1，5:1，3:1，1:1v:v)体系进行梯度洗脱，经薄层色谱检测合并相同段，得4部分样品(c1-c4)。c2(1.3g)经葡聚糖凝胶柱及半制备的高效液相乙腈-水体系分离得化合物3(30mg)。c32半制备的高效液相乙腈-水体系分离得化合物4(25mg)。
二、制备的产物的结构鉴定
表1和表2为制备的产物的核磁共振氢谱和碳谱数据。
化合物1
hresims：[m+na]+m/z：493.2195(calcd493.2197)。
化合物2
分子式：c28h40o9
分子量：520.27
hresims:[m+na]+m/z:543.2571(calcd,543.2570)。
化合物4
表1制备的产物的核磁共振氢谱(δinppm,incdcl3,jinhz,in600mhz.)
表2制备的产物的核磁共振碳谱(δinppm,incdcl3,in600mhz.)
三、制备的化合物式(ⅰ)对黑麦草的植物毒活性实验
1.供试植物的培养
本实施例中以黑麦草为实验材料，采用平板培养法。首先将种子在冷水中浸泡8小时，然后用3％的次氯酸浸泡5分钟。然后，将种子用无菌水清洗至无次氯酸味(约6次)后放置在用无菌水湿润的含两层无菌滤纸的大培养皿中，在恒定温度为23℃的培养箱中进行萌发，培养时间为3天。
2.测定化合物式(ⅰ)对四种植物的毒活性
实验在12孔板中进行，草甘膦作为阳性对照药物。将草甘膦和本发明化合物用dmso溶解，再用无菌蒸馏水配成浓度为200μg/ml的溶液，以相同浓度的dmso水溶液作为空白对照，dmso的浓度不超过1％，取600μl的处理液和对照液加入12孔板中(每个孔放置两层无菌滤纸)，选取大小相仿，萌发状态一致的黑麦草幼苗放入12孔板中，每个处理组设置3组重复，每个孔放10个幼苗。然后放入到23℃的培养箱中进行培养，培养3天。取出幼苗测量根长和叶鞘的长度，并计算抑制率。抑制率的计算公式：抑制率＝(对照组数据-处理组数据)/对照组数据*100％。
3.实验结果
表3为化合物式(ⅰ)与草甘膦(阳性对照)对黑麦草根和叶鞘的植物毒活性。在浓度为200μg/ml下，本发明化合物对黑麦草的根表现出明显的植物抑制活性，其抑制率均强于阳性对照草甘膦的抑制率，尤其是化合物1和2，抑制率达到98％和96％。化合物1对黑麦草叶鞘的抑制率也高于阳性对照草甘膦，化合物2，3，4对叶鞘的抑制作用与草甘膦相当。
表3化合物式(ⅰ)与草甘膦对黑麦草的植物根和叶鞘的毒活性
综上所述：化合物式(ⅰ)对黑麦草有较强的抑制活性，可作为一种新型除草剂的先导化合物，为合成化学家提供模板分子，也为发展新型的，低毒的除草剂提供了新思路。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。