一种前列腺癌早期诊断方法与流程

[0001]
本发明涉及临床诊断领域，具体涉及一种基于体液中psma(前列腺特异性膜抗原)阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡中amacr(α甲基酰基辅酶a消旋酶)表达量来早期诊断前列腺癌的方法。


背景技术：

[0002]
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，发病随年龄增长而增加，全球范围内居男性恶性肿瘤发病率的第3位，病死率的第6位。相比于欧美发达国家，我国的前列腺癌发病率相对较低，但随着社会的不断发展进步，近年来发病率呈持续快速上升趋势，已成为影响中国男性健康的重要疾病之一。
[0003]
目前，psa检测仍是前列腺癌早期筛查的主要方法，psa＞4ng/ml的患者需行前列腺穿刺进一步排查；但随着psa在临床上的广泛应用，也发现其存在较多的局限性。psa不具备肿瘤特异性，前列腺良性增生、前列腺炎和前列腺相关医源性操作均可导致psa升高。psa在4.0-10.0ng/ml之间行前列腺穿刺的患者中，约75％穿刺阴性。2004年，thompson研究发现17％的前列腺癌患者psa在1.1-2.0ng/ml之间，14.9％的高级别前列腺癌psa≤4.0ng/ml。探索一种具有高度敏感性、高度前列腺器官特异性和高度肿瘤特异性的标记物已经成为前列腺癌研究的重要方向。
[0004]
amacr是存在于线粒体和过氧化物酶体中的一种酶，它参与支链脂肪酸(包括降植烷酸)和胆汁酸的代谢，在支链脂肪酸和胆汁酸中间物-二羟胆甾烷醇酸和三羟基胆甾烷醇酸的β氧化中起着关键的作用，它能将α甲基支链脂酰基辅酶a(r型)催化转化为其立体异构体(s型)，只有s位有2甲[烷]基的立体异构体才能通过过氧化物酶体(β氧化途径的第一个酶)进行代谢。amacr表达于正常肾脏和肝脏组织，以及包括前列腺癌、肝癌、肾癌、结直肠癌在内的多种肿瘤。2001年，jiang等报道amacr在入组的所有137例(100％)前列腺腺癌组织中均见表达，而对照组中88％(171/194)的良性前列腺组织中未见表达，提出amacr是前列腺癌高度敏感和特异的阳性标记物。beach报道82％(153/186)的前列腺癌组织中见amacr表达。magi-galluzzi等发现在不同组别前列腺腺癌组织中，amacr表达的敏感性在80-100％之间。其他研究还表明，对于那些很小的、非典型的腺体，amacr诊断前列腺癌的灵敏度为82％～100％，特异性为79％-100％；对于穿刺标本的小腺癌和临床诊断中有争议的标本，amacr的灵敏度可达94.5％-100％。目前，amacr已被广泛应用于前列腺癌的组织病理诊断，尚无在体液中应用amacr早期诊断前列腺癌的报道。
[0005]
amacr在组织中可以有效地区分前列腺癌和良性疾病，但不是一种分泌蛋白且不具备前列腺组织特异性，这大大限制了开发其成为前列腺癌血液标志物的前景。psma是一种存在于前列腺上皮细胞的ii型固有蛋白，主要表达于前列腺上皮细胞和肿瘤血管新生上皮细胞，在卵巢、乳房、肾脏、脑组织、腮腺等组织中有少量表达；具有较高的前列腺组织特异性。组织中的前列腺癌细胞可以脱落进入循环血形成循环肿瘤细胞，还可以分泌或脱落具有双层膜结构的囊泡状小体进入组织间液和循环血，形成细胞外微囊泡(emv，包括外泌
体、凋亡小体等)；循环肿瘤细胞和细胞外微囊泡携带了大量来自于前列腺癌细胞的蛋白质、核酸以及一些其他肿瘤细胞信息，细胞膜或囊泡表面表达psma，而细胞或囊泡内部存在amacr。分选psma阳性的循环肿瘤细胞和细胞外微囊泡以检测其内部的amacr，在理论上具备了循环血可检测性、器官特异性和肿瘤特异性，而敏感性需进一步实验验证。
[0006]
有鉴于此，特提出此项发明。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供了一种基于体液中psma(前列腺特异性膜抗原)阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡中amacr(α甲基酰基辅酶a消旋酶)表达量来早期诊断前列腺癌的方法。发明内容主要包括两个方面：第一个方面是体液中psma阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡的提取；第二个方面是amacr蛋白的定量检测。
[0008]
本发明所涉及的体液包括循环血、尿液、组织间液、唾液和粪便。
[0009]
体液中psma阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡的提取方法包括磁珠分选和流式分选。
[0010]
amacr的定量检测方法包括western blot、elisa和质谱蛋白定量分析。
附图说明
[0011]
图1为本发明实例的原理示意图；
[0012]
图2为本发明实例中得到的外周血中psma阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡中amacr表达量在前列腺癌和良性前列腺增生中存在表达差异。
具体实施方式
[0013]
下面结合实例对本发明做详细的阐述，此实例仅用于更加清楚地说明本专利的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0014]
实施例：应用循环血中psma阳性的肿瘤细胞和细胞外微囊泡中amacr表达量来鉴别前列腺癌和良性前列腺增生。
[0015]
实验方法：将适量生物素标记的psma抗体与适量链霉亲和素标记的磁珠加入1.5ml ep管中混匀，将ep管置于旋转混合仪上过夜；第二天将ep管放于磁力架上，pbs清洗磁珠3遍，即得到psma抗体包被的磁珠，备用。取患者外周静脉血2ml于室温静置5分钟，4000g离心15分钟，取上清备用。取200ul血清于1.5mlep管，加pbs稀释至1ml，加入适量psma抗体包被的磁珠，将ep管置于旋转混合仪上过夜；第二天将ep管放于磁力架上，pbs清洗磁珠3遍，外周血中psma阳性的肿瘤细胞和微囊泡即吸附在磁珠上。加适量ripa和蛋白酶抑制剂浸泡磁珠提取蛋白，后行western blot检测amacr蛋白表达量。检测结果表明，前列腺癌患者外周血中psma阳性肿瘤细胞和细胞微囊泡中amacr蛋白表达量显著高于前列腺良性增生患者，外周血中psma阳性肿瘤细胞和细胞微囊泡中amacr蛋白表达量可以作为前列腺癌早期诊断标志物。