一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒的制作方法

本发明属于临床医学检测领域，具体涉及一种用于动态监测凝血酶生成能力，能对出凝血状况进行评价的试剂盒。
背景技术：
：凝血酶(thrombin)是机体凝血系统中一类非常重要的丝氨酸蛋白酶，它由308个氨基酸残基组成，分子量为37kd；凝血酶由a链和b链残基组成，通过残基c1和c122之间的二硫键共价连接。b链是酶的活性位点和所有已知的活性表位的入口。位于分子后部的a链被认为是凝血酶原激活过程的附属物。然而，包括a链在内的凝血酶原分子的自然变异与严重出血有关。凝血酶在凝血系统中具有促凝和抗凝双重功能，在抗凝上，可使纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块，这对于血小板在伤口(病变)部位的固定和愈合过程的启动至关重要；在促凝上，凝血酶通过与完整内皮细胞的凝血调节蛋白结合，进而激活蛋白c发挥抗凝血作用。凝血酶-血栓调节蛋白相互作用降低了凝血酶裂解纤维蛋白原的能力，但增强了酶对活化蛋白c的亲和力。活化蛋白c使活化因子v(fva)和viii(fviiia)的活性形式失活，这是活化因子x(fxa)和ix(fixa)的两个基本辅因子，从而降低凝血酶的生成。凝血酶是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，血栓与止血过程中发挥着重要的作用。所有血栓风险增加或出血风险增加的机理皆可引起凝血酶生成的增加或减少。凝血酶生成实验能够实时检测样本中凝血酶的生成过程及生产量，检测结果对临床疾病的早期诊断、病程发展、疗效的监测和机体出血凝血状况评估等都具有非常重要的意义。glu-gly-arg-amc是凝血酶特异性的荧光底物，可用于检测富血小板血浆(prp)和乏血小板血浆(ppp)中凝血酶的生成。具有蛋白水解活性的凝血酶形成后，凝血酶的b链可以使荧光底物(glu-gly-arg-amc)裂解出荧光基团amc(7-氨基-4甲基香豆素)，荧光基团amc具备最大吸收波长：344nm和最大发射波长440nm的光学特征，并且荧光基团amc的量与凝血酶的量具有相关性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种实时监测凝血酶生成能力，能对出凝血状况进行评价的试剂盒。该试剂盒与常规的试剂盒相比，是首个动态全过程监测凝血酶生成能力的试剂盒，是最佳的止凝血全过程的描述者，是目前凝血功能实验的重要补充，更接近于临床表现，可作为重要的临床诊断工具在临床上推广应用。该检测试剂盒还具有较好的稳定性和重复性。本发明提供的试剂盒包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：3.5～5.5ml/l，兔脑组织因子：3.5～5.5ml/l，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/l；所述荧光试剂含有以下成分：glu-gly-arg-amc：0.5～1.0mmol/l，二甲基亚砜:0.5～1.5ml/l，牛血清白蛋白：2.5～7.5g/l，甘氨酸：30～50g/l，proclin300：0.05～0.15ml/l。优选地，所述反应试剂含有以下成分：兔脑磷脂：4.5ml/l，兔脑组织因子：4.5ml/l，牛血清白蛋白：5.0g/l。优选地，所述荧光试剂含有以下成分：glu-gly-arg-amc:1mmol/l，二甲基亚砜：1ml/l，牛血清白蛋白：5g/l，甘氨酸：40g/l，proclin300：0.1ml/l。优选地，所述反应缓冲液含有以下成分：氯化钠：4.5～13.5g/l，hepes：10.0～20.0g/l；tris：ph7～7.5，proclin300：0.05～0.15ml/l。所述氯化钙试剂选择常规凝血检测中使用的25mmol/l氯化钙试剂，所述氯化钙试剂含有以下成分：氯化钙：1.7～3.9g/l，proclin300：0.05～0.15ml/l。优选地，所述反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂的体积比为10:15:50:35。以上试剂或溶液的溶剂均为电导率≤1μs/cm(25℃)的纯化水。本发明的检测原理：在待测血浆中加入含有兔脑组织因子(tf)和兔脑磷脂的反应试剂，激活凝血系统，氯化钙试剂中的ca2+作为促发剂，激活凝血反应，最终使凝血酶原活化形成凝血酶，生成的凝血酶作用于荧光试剂(glu-gly-arg-amc)，使之裂解并释放荧光基团(amc)，荧光基团(amc)在360nm波长的激发光激发下，发射出460nm的荧光，荧光强度与凝血酶生成呈相关性。通过监测荧光强度来实时监测凝血酶的生成，反映出凝血酶生成的时间和生成量，进而对出凝血状况进行评价。本发明中兔脑磷脂是代替能提供磷脂的血小板因子，为凝血反应提供丰富的催化表面；兔脑组织因子及fⅲ，是唯一不存在健康人血浆中的凝血因子，广泛存在各种组织中，尤其是脑、胎盘和肺组织中含量尤为丰富，在血管内皮受损时释放于血液中，是血液凝固的始动因子；甘氨酸，能抑制ph值的改变，阻止凝血酶蛋白的变性；选用牛血清白蛋白，可有效阻止蛋白分子表面的吸附，使蛋白分子在水溶液中容易保持其稳定结构，不易变性失去活性，并且在冻干试剂中与甘氨酸形成冻干品的骨架物质；选用氯化钠能与蛋白质形成复杂的静电相互作用而稳定酶蛋白；proclin300作为一种生物防腐剂，即能有效抑制微生物的繁殖，又能避免因微生物的污染，同时还可以保持活性物质的活性；选用hepes-tris作为缓冲体系，能保持ph的稳定，且能保持活性物质的稳定；二甲基亚砜是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，能够使不易溶于纯化水的荧光底物(glu-gly-arg-amc)充分溶解后，再与纯化水进行充分混合。所述的动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，在具有持续发射360nm波长的激发光，并能每隔15s检测一次460nm发射光的荧光检测模块，分析软件可以计算被测样本中实时凝血酶的生成。在整个凝血过程中，结果以每个点的实时凝血酶生成(nm)来计算。样本中加入兔脑磷脂/兔脑组织因子混合物及氯化钙后开始凝固，在经过一段延迟期(tlag)后凝血酶生成量达到或超过阈值，开始计算凝血酶生成量，到凝血酶生成速率最大值即为(peak)的时间(tpeak)，然后凝血酶的生成逐渐减少，直到凝血酶生成量低于检测阈值的全过程监测，凝血酶生成曲线的积分面积即表示凝血酶生成量，见附图2，其具体使用方法如下：(1)将待检测的血浆40ul加入到反应杯中；(2)将反应试剂:反应缓冲液:荧光试剂:氯化钙试剂使用时按10ul:15ul:50ul:35ul比加入到待测血浆中；(3)加入氯化钙试剂，37℃温育并进行荧光检测，将测试结果与凝血酶校准曲线对比，得到待测样品的凝血酶含量，并且记录从检测开始到检测结束时间作为凝血酶生成时间。本发明的有益效果：(1)凝血酶的测定能提供更多的信息：凝血酶生成的量，凝血酶活性状态的持续时间；(2)荧光信号受浊度的影响小，凝块的出现不会影响信号，血小板的存在也不会干扰测量，这使得研究血小板在大样本凝血中的作用成为可能；(3)动态的全过程凝血酶生成监测，能真实准确的反映整个凝血过程，可以更加准确对出凝血状况进行评估；(4)是最佳的止凝血全过程的描述者，是目前凝血功能实验的重要补充；(5)了解凝血机制和病人管理研究中具有潜在的应用。附图说明图1为凝血酶浓度与荧光强度的校准曲线。图2为本发明实时检测过程曲线及报告参数示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种动态监测凝血酶生成能力的试剂盒，包括反应试剂、反应缓冲液、荧光试剂及氯化钙试剂，各试剂的组成如下：(1)反应试剂：兔脑磷脂：4.5ml/l兔脑组织因子：4.5ml/l牛血清白蛋白：5.0g/l(2)反应缓冲液：氯化钠：9.0g/lhepes：15.0g/ltris：ph7.25±0.1proclin300：0.1ml/l(3)荧光试剂：glu-gly-arg-amc:1mmol/l二甲基亚砜：1ml/l牛血清白蛋白：5g/l甘氨酸：40g/lproclin300：0.1ml/l(4)氯化钙试剂：氯化钙：2.8g/l，proclin300：0.05ml/l。本试验例所述试剂盒，在使用时，其测定是采用具有分析系统的荧光检测模块。测试中选用混合血浆，为多人份血浆进行混合，各成分比较均衡，最接近正常血浆。具体操作如下：(1)标准曲线绘制绘制标准曲线时，用纯化水稀释并定容浓度为1682iu/l的凝血酶溶液，分别稀释成一系列不同浓度的凝血酶标准溶液。荧光模块检测是在室温条件下进行的，检测结果显示出凝血酶与荧光强度的对应关系，凝血酶浓度越高，荧光强度越强，反之凝血酶浓度越小，荧光强度越弱，如表1：表1不同浓度凝血酶测得的对应荧光强度以荧光强度为纵坐标(y轴)，其相应凝血酶标准溶液的浓度为横坐标(x轴)，绘制相应的标准工作曲线，计算得到凝血酶标准工作曲线的回归方程。如附图1为凝血酶浓度与荧光强度的校准曲线。(2)按表2加样顺序及加样量操作步骤吸取血浆样本加入到反应杯中：表2加样顺序及加样量加样顺序试剂加样量1待测血浆40ul2反应试剂10ul3反应缓冲液15ul4荧光试剂50ul5氯化钙试剂35ul仪器自动进行37℃温育并进行荧光检测，将测试结果与凝血酶校准曲线对比，记录待测血浆样本的凝血酶生成量及凝血酶生成时间。检测结果除凝血酶生成曲线外，还同时用相关参数表示，如附图2。主要参数为：延迟时间(tlag)，即从反应开始到凝血酶开始生成所经历的时间；达峰时间(tpeak)，即从反应开始到凝血酶达到最大量所经历的时间；峰值(peak)，即生成的凝血酶的最大量；曲线下面积(areaunderthecurve，auc)，即凝血酶生成曲线下的积分面积，反映每分钟凝血酶生成的量。实施例2最适反应试剂a.兔脑磷脂和兔脑组织因子浓度：兔脑磷脂3.5ml/l，兔脑组织因子：3.5ml/l，牛血清白蛋白：2.5g/l；b.兔脑磷脂和兔脑组织因子浓度：兔脑磷脂：4.5ml/l，兔脑组织因子：4.5ml/l，牛血清白蛋白：5g/l；c.兔脑磷脂和兔脑组织因子浓度：兔脑磷脂：5.5ml/l，兔脑组织因子：5.5ml/l，牛血清白蛋白：7.5g/l；反应缓冲液、荧光试剂和氯化钙试剂均按实施例1进行配制，冻干品用纯化水复溶，按上述操作步骤，a、b、c三种反应试剂在tc全自动血凝仪alpha上检测混合血浆的结果，见表3。表3不同浓度反应试剂对测定结果的影响表3结果显示a、b、c均能对混合血浆进行测试，而b测试结果处于a、c测试结果中间，选择b作为最适浓度，主要是测试结果时间参数(tlag和tpeak)不至于过长，也不至于过短；凝血酶生成参数(peak和auc)不至于过大或过小，有利于对测试结果进行分析，所以b为最适反应试剂。实施例3最适荧光试剂a.荧光试剂：glu-gly-arg-amc:0.5mmol/l，二甲基亚砜:0.5ml/l，血清白蛋白：2.5g/l，甘氨酸：30g/l，proclin300：0.05ml/l，其余为纯化水；b.荧光试剂：glu-gly-arg-amc:1mmol/l，二甲基亚砜:1ml/l，血清白蛋白：5g/l，甘氨酸：40g/l，proclin300：0.1ml/l，其余为纯化水；c.荧光试剂：glu-gly-arg-amc:1.5mmol/l，二甲基亚砜:1.5ml/l，血清白蛋白：7.5g/l，甘氨酸：50g/l，proclin300：0.15ml/l，其余为纯化水；反应试剂、反应缓冲液和氯化钙试剂均按实施例1进行配制，冻干品用纯化水复溶，按上述操作步骤，a、b、c三种试剂在tc全自动血凝仪alpha上检测混合血浆的结果；另外按表2的加样体系中待测血浆改为80ul，其它条件不变的情况下，检测混合血浆的结果，见表4。表4不同浓度荧光试剂对测定结果的影响表4结果显示a、b、c三种荧光底物浓度对混合血浆进行测试，加样体系待测血浆40ul中，a中生成的凝血酶使荧光底物(glu-gly-arg-amc)全部裂解，释放出amc，而荧光底物(glu-gly-arg-amc)不足，b、c中荧光底物(glu-gly-arg-amc)能满足生成的凝血酶全部用于裂解；加样体系待测血浆80ul，随着凝血酶生成量的增多，a中荧光底物(glu-gly-arg-amc)不足，而b、c中荧光底物(glu-gly-arg-amc)仍然能够满足反应需求。反应过程中各成分量的不同，检测结果会有所差别。综合分析，b中荧光底物浓度可以满足检测需求，所以b为最适荧光试剂。实施例4血清中加标回收实验采用标准加入法向人混合血清中加入标准的凝血酶以配制成不同浓度的血清样品。血清是血液凝固后，去除纤维蛋白后所留下来的血浆。血清的化学成分和血浆类似，但不含有凝血蛋白。每一组加标实验都重复3组平行实验，表3中的最终数据是3组平行实验的平均值，见表5血清加标回收实验凝血酶样品回收率。表5加标回收实验结果表5结果表明，凝血酶的回收率在96.5％至102.4％之间，相对标准偏差在2％至80％之间，本发明准确性和重复性较好，可以满足定量需要。实施例5重复性测试在重复性条件下，用试剂盒测试同一混合血浆20次，按分别计算tlag、tpeak、peak、auc四个参数测量值的平均值和标准差(s)及变异系数(cv)。见表6。表6重复性试验结果表6表明，本发明的试剂和变异系数(cv)较小(小于7％)，重复性较好。实施例6试剂盒对不同含量凝血酶测试混合血浆用0.9％的生理盐水进行倍比稀释后检测(生理盐水稀释2、4、8、16、32和64倍)，检测结果见表7。表7不同血浆稀释倍数测得的凝血酶生成量表7表明，本发明的试剂盒随着血浆在凝血酶的减少，其检测结果在时间上(tlag和tpeak)逐渐延长，凝血酶生成量(peak和auc)逐渐减少，检测结果说明本发明的试剂盒对血浆中凝血酶比较敏感，同时也对生成过程实时监测，这一结果对临床来说非常重要，即能够分析凝血酶生成时间和生成量，也能对生成过程进行分析。上述所述仅是本发明的优选实施方式及试验例，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或润饰。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完说明书页成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12