农药残留的比色和/或SERS检测及检测胶体制备方法与流程

本发明涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种农药残留的比色和/或sers检测及检测胶体制备方法。

背景技术：

农药已被广泛用于防治病虫害以及调节植物生长中。然而，农药残留对环境有潜在危害，甚至导致健康问题，如神经中毒、肝病、甚至癌症。因此，实现对果蔬中农药残留的原位检测具有重要意义。气相色谱、液相色谱、高效液相色谱和质谱等分析方法已被广泛用于农药残留的检测，这些方法的检测结果具有很高的精度，被认为是黄金标准。但是，上述方法存在一些不足，它们通常昂贵、耗时并且依赖于专业人员。

目前，基于金纳米颗粒(aunps)溶液的比色法已应用于农药残留的检测中。该方法利用aunps的“聚集-分散”实现比色法检测农药分子：农药分子与aunps的相互作用(静电吸附作用及化学相互作用)致使分散的aunps聚集，从而导致aunps的等离子体共振波长向长波长方向移动，伴随aunps溶液的颜色由酒红色变为紫色最终变为蓝色。在一定范围内，农药的浓度越大，aunps等离子体共振波长的移动和aunps溶液颜色的变化越明显。因此，通过对aunps等离子体波长的变化和对溶液颜色的观察可以实现对农药浓度的测量。比色法农药测量具有高灵敏检测、快速响应和裸眼可分辨等优点，适用于果蔬表面农药残留可视化的大面积快速检测。但是，基于aunps溶液的比色过程通常是快速、强烈的，在不同浓度农药的诱导下，aunps溶液由酒红色变为蓝色，一段时间后均呈无色透明的过度聚集状态，很难把握测定时间，从而影响测定精度；此外，大多数比色法是针对试管中的液体样品进行的，不适用于果蔬表面农药残留的原位检测。

近年来，表面增强拉曼光谱(sers)被认为是快速、无损检测分析物的可靠方法，能够获取待测农药分子的“指纹”光谱信息，快速判断农药的种类，具有特异性。在上述比色法大面积可视化测量浓度分布的基础上，sers可针对某些点进行确认和验证。aunps作为具有局域表面等离子体共振特性的纳米材料，是sers中最常用的增强基底之一。目前已有一些基于aunps溶液的比色和sers结合的研究，然而这些研究中sers测量的部分均需将待测液体样品转移到镀金载玻片上进行sers检测，并未实现原位测量。

综上所述，目前比色/sers联用技术在农药检测的中存在的问题是：1.测量对象主要是液体样品，对果蔬(固体)中农药的测量有局限性；2.比色反应剧烈、不可控，很难把握测定时间，影响测定精度；3.没有实现sers的原位测定。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提出一种农药残留的比色和/或sers检测及检测胶体制备方法，设计制备了聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体(pva-au)作为比色和sers双传感器。聚乙烯醇(pva)具有光学透明、水溶性强、有粘性等物理特性，pva粉末与aunps溶液混合得到的pva-au呈胶体状，能够使比色过程稳定可控，从而提高检测体系的稳定性和准确性；同时易于附着在待测样品表面，使pva-au与待测农药分子接触更紧密，从而提高灵敏性，实现原位检测。

为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种农药残留的比色和/或sers检测方法，其包括以下步骤：

s11：制备聚乙烯醇-金纳米颗粒(pva-au)胶体；

s12：建立关于聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的待检测农药的浓度比色法标准定标曲线；

s13：根据浓度比色法标准定标曲线测量待检测果蔬样品中残留的待检测农药的浓度；和/或，采用拉曼光谱仪对滴过聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的待检测果蔬样品表面进行表面增强拉曼光谱检测，以确认其指纹光谱信息，从而确定待检测农药的种类；

较佳地，所述s11进一步包括：将聚乙烯醇粉末与金纳米颗粒溶液混合得到聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体。

较佳地，所述s11进一步包括：

s111：将预设容量以及预设浓度的柠檬酸钠溶液加入沸腾的预设容量以及预设浓度的四氯金酸溶液中，继续沸腾预设时间后停止加入；

s112：将所述s111得到的溶液冷却至室温后以预设转速离心预设时间，移除上清液，得到金纳米颗粒溶液；

s113：将聚乙烯醇粉末加入到所述s112得到的金纳米颗粒溶液中搅拌至均匀混合，得到聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体。

较佳地，所述聚乙烯醇粉末与金纳米颗粒溶液的质量体积比为5mg：2ml。

较佳地，所述s113中将聚乙烯醇粉末加入到所述s112得到的金纳米颗粒溶液中搅拌至均匀混合之后还包括：对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。

较佳地，所述s113中的对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值具体为：加入稀hcl或稀hno3对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。

较佳地，所述预设ph值为弱酸性，最佳地ph值为5，该ph值下聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体分布均匀、且对农药的比色测定更灵敏。

较佳地，所述s12具体包括：

s121：配置不同浓度的待检测农药溶液，喷洒于果蔬表面，烘干，得到有待检测农药残留的果蔬样品；

s122：取预设容量的聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体滴在所述s121得到的果蔬样品的表面，反应稳定后，在第一波长以及第二波长的led光源下，用相机采集果蔬样品表面照片，读取照片的灰度值，根据灰度值计算果蔬样品的反射率；

s123：通过第一波长的led光源照射下得到的反射率与第二波长的led光源照射下得到的反射率的比值以及待检测农药溶液的浓度之间的关系制作浓度定标曲线。

较佳地，所述s122中的所述第一波长以及第二波长的选择方法为：通过测定聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体的紫外吸收光谱，发现在待检测农药存在时聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体的吸收峰由第一波长向第二波长移动，由此得到第一波长以及第二波长。

较佳地，所述s122中所述根据灰度值计算反射率r的方法为：r(λ)＝(g-gd)/(gr-gd)。其中λ为led的波长，g为led光源下ccd相机捕获样品图像的灰度值，gr为同一led光源下获取参考平面图像的灰度值，gd为暗室中获取参考平面图像的灰度值。

本发明还提供一种农药残留的检测胶体制备方法，其包括以下步骤：

s81：将聚乙烯醇粉末与纳米金颗粒溶液混合得到聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体。

较佳地，所述s81进一步包括：

s811：将预设容量以及预设浓度的柠檬酸钠溶液加入沸腾的预设容量以及预设浓度的四氯金酸溶液中，继续沸腾预设时间后停止加入；

s812：将所述s811得到的溶液冷却至室温后以预设转速离心预设时间，移除上清液，得到金纳米颗粒溶液；

s813：将聚乙烯醇粉末加入到所述s812得到的金纳米颗粒溶液中搅拌至均匀混合，得到聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体。

较佳地，所述聚乙烯醇粉末与金纳米颗粒溶液的质量体积比为5mg：2ml。

较佳地，所述s813中将聚乙烯醇粉末加入到所述s812得到的金纳米颗粒溶液中搅拌至均匀混合之后还包括：对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。

较佳地，所述s813中的对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值具体为：加入稀hcl或稀hno3对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。

较佳地，所述预设ph值为弱酸性，最佳地ph值为5，该ph值下聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体更稳定、分布更均匀。

相较于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的农药残留的比色和/或sers检测及检测胶体制备方法，通过制备聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体(pva-au)作为比色和sers双传感器，pva-au胶体比传统的aunps溶液更稳定，不易变质，便于保存备用；另外，pva-au胶体使比色检测过程稳定可控，有益于准确测定；

(2)本发明提供的农药残留的比色和/或sers检测及检测胶体制备方法，通过制备的pva-au胶体具有粘性，易于附着在待测样品表面，促进pva-au与待测分子的紧密接触，从而提高测定的灵敏度，实现原位比色/sers测定；

(3)本发明提供的农药残留的比色和/或sers检测及检测胶体制备方法，适用于不同颜色果蔬的检测中，具有灵敏度高、快速响应、裸眼可视的优点。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明：

图1为本发明的实施例1的农药残留的比色检测方法的流程图；

图2为本发明的实施例2的农药残留的sers检测方法的流程图；

图3为本发明的实施例3的农药残留的比色以及sers检测方法的流程图；

图4a、4b为本发明的一实施例的聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的扫描电镜图，标尺为200nm；

图5为本发明的一实施例的不同浓度的福美双存在下聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的吸收光谱；

图6a、6b为本发明的一实施例的对比不同浓度的福美双残留，aunps溶液与pva-au胶体反射率的比值随反应时间的变化；

图7为本发明的一实施例的福美双浓度比色法标准定标曲线；

图8为本发明的一实施例的苹果上原位采集的福美双sers光谱。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

结合图1，本实施例对本发明的农药残留的比色检测方法进行详细描述，如图1所示，其包括以下步骤：

s11：制备聚乙烯醇-金纳米颗粒(pva-au)胶体；

s12：建立关于pva-au胶体的待检测农药的浓度比色法标准定标曲线；

s13：根据浓度比色法标准定标曲线测量待检测果蔬样品中残留的待检测农药的浓度。

实施例2：

结合图2，本实施例对本发明的农药残留的sers检测方法进行详细描述，如图2所示，其包括以下步骤：

s11：制备聚乙烯醇-金纳米颗粒(pva-au)胶体；

s12：建立关于聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的待检测农药的浓度比色法标准定标曲线；

s14：采用拉曼光谱仪对滴过pva-au胶体的待检测果蔬样品表面进行表面增强拉曼光谱检测，以确认其指纹光谱信息，从而确定待检测农药的种类。

实施例3：

结合图3，本实施例对本发明的农药残留的比色以及sers检测方法进行详细描述，如图3所示，其包括以下步骤：

s11：制备聚乙烯醇-金纳米颗粒(pva-au)胶体；

s12：建立关于聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的待检测农药的浓度比色法标准定标曲线；

s13：根据浓度比色法标准定标曲线测量待检测果蔬样品中残留的待检测农药的浓度；

s14：采用拉曼光谱仪对滴过聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体的待检测果蔬样品表面进行表面增强拉曼光谱检测，以确认其指纹光谱信息，从而确定待检测农药的种类。

上述实施例中，s13和s14的顺序可以互换，也可以先进行s14，再进行s13。

较佳实施例中，s11进一步包括：将聚乙烯醇(pva)粉末与金纳米颗粒溶液(aunps溶液)混合得到聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体。

较佳实施例中，s11进一步包括：

s111：将3ml1％(w/w)的柠檬酸钠溶液快速加入沸腾的100ml0.25mm的四氯金酸溶液中，继续沸腾30min后停止加热；

s112：s111得到的溶液自然冷却至室温后以1000rpm的转速离心10min，移除上清液，下层浓缩部分即为aunps溶液；

s113：将pva粉末加入aunps溶液中搅拌至均匀混合，得到pva-au，可将其密封于离心管中保存。

需要说明的是，上述实施例中的各种溶液、粉末的参数以及转速参数、时间参数都可以根据需要进行不同的变换。

较佳实施例中，s113中的pva粉末与aunps溶液的质量体积比为5mg：2ml。

较佳实施例中，s113中的均匀混合之后还包括：对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。较佳地，预设ph值为弱酸性，最佳地ph值为5，该ph值下聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体分布均匀、且对农药的比色测定更灵敏。

较佳实施例中，上述的调节ph值的方法为：加入稀hcl或稀hno3对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。当然，不同实施例中，也可加入其它的酸性溶液或碱性溶液对ph值进行调节，此处不再赘述。

较佳实施例中，s12进一步包括：

s121：配置不同浓度的待检测农药溶液，喷洒于果蔬表面，烘干，得到有待检测农药残留的果蔬样品；

s122：取预设容量的聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体滴在s121得到的果蔬样品的表面，反应稳定后，在第一波长以及第二波长的led光源下，用相机采集果蔬样品表面照片，读取照片的灰度值，根据灰度值计算果蔬样品的反射率；

s123：通过第一波长的led光源照射下得到的反射率与第二波长的led光源照射下得到的反射率的比值以及待检测农药溶液的浓度之间的关系制作浓度定标曲线。

较佳实施例中，s122中的第一波长以及第二波长的选择方法为：通过测定聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体的紫外吸收光谱，发现在待检测农药存在时聚乙烯醇粉末-金纳米颗粒胶体的吸收峰由第一波长向第二波长移动，由此得到第一波长以及第二波长。

较佳实施例中，，s122中的根据灰度值计算反射率r的方法为：r(λ)＝(g-gd)/(gr-gd)。其中λ为led的波长，g为led光源下ccd相机捕获样品图像的灰度值，gr为同一led光源下获取参考平面图像的灰度值，gd为暗室中获取参考平面图像的灰度值。

下面以福美双农药为例对上述实施例进行具体描述，如图4a所示为未加入福美双农药时的pva-au的扫描电镜图，比较分散，如图4b所示为加入福美双农药时的pva-au的扫描电镜图，比较聚集。s12具体包括：

s121：准确配置不同浓度的福美双溶液，喷洒于果蔬表面，室温下自然风干，得到有福美双残留的果蔬样品；

s122：取10μlpva-au胶体直接滴在果蔬样品表面，反应稳定后，在第一波长以及第二波长的led光源下，用单色ccd相机采集果蔬样品照片，测量果蔬样品的反射率，通过反射率比值及福美双浓度的关系制作浓度定标曲线；如图5所示给出了不同浓度的福美双存在下pva-au胶体的吸收光谱，图中福美双的浓度分别为：0，100，500，2000ppb；

s123：通过第一波长的led光源照射下得到的反射率与第二波长的led光源照射下得到的反射率的比值以及福美双溶液的浓度之间的关系制作浓度定标曲线。

较佳实施例中，s121中配置的福美双溶液的浓度分别为5,10,50,100,500,1000,2000ppb。

较佳实施例中，通过测定pva-au胶体的紫外吸收光谱，发现在福美双存在时pva-au胶体的吸收峰由520nm向620nm移动，因此选择波长为520nm和620nm的led作为光源。不同实施例中，农药种类不同时，选定波长也可能不同，根据实际测量而定。

较佳实施例中，反射率表示为r(λ)＝(g-gd)/(gr-gd)。其中λ为led的波长，g为led光源下ccd相机捕获样品图像的灰度值，gr为同一led光源下获取参考平面图像的灰度值，gd为暗室中获取参考平面图像的灰度值。上述实施例中，反射率比值即为r(520)/r(620)。如图6a、6b为该实施例的对比不同浓度的福美双残留，aunps溶液与pva-au胶体反射率比值随反应时间的变化。图6a说明在不同浓度福美双残留下，aunps溶液的反射率比值随反应时间迅速变大，在15min后稳定在相似的比值，几乎无法根据反射率比值判断福美双残留浓度。图6b中pva-au胶体在不同浓度福美双存在下，反应约11min后，反射率比值r(520)/r(620)稳定，随着福美双残留浓度的增大，反射率比值r(520)/r(620)越大，可根据反射率比值测定福美双残留浓度。相比aunps溶液，pva-au胶体使比色检测过程稳定可控，有益于准确测定。

下面选用梨(黄)、苹果(红)、蔬菜(绿)三种果蔬中福美双农药残留测定为例，如图7所示为实施例果蔬样本的福美双浓度比色法标准定标曲线图；如图8所示为苹果上原位采集的福美双sers光谱。福美双的浓度为5ppm。表1所示为实施例果蔬样本中福美双浓度比色定标曲线方程、拟合度(r2)及最低检测限(lod)。

表1

测定结果显示pva-au胶体适用于比色测定不同颜色果蔬样品中的福美双(pka＝7.82)残留，同时pva-au胶体又可作为sers基底，原位获取福美双的“指纹”光谱信息，在大面积可视化测量浓度分布的基础上，可针对某些点进行确认和验证。

实施例4：

本实施例对本发明的农药残留的检测胶体制备方法进行详细描述，其包括以下步骤：

s81：将聚乙烯醇粉末与纳米金颗粒溶液混合得到聚乙烯醇-金纳米颗粒胶体。

较佳实施例中，s81进一步包括：

s811：将3ml1％(w/w)的柠檬酸钠溶液快速加入沸腾的100ml0.25mm的四氯金酸溶液中，继续沸腾30min后停止加热；

s812：s811得到的溶液自然冷却至室温后以1000rpm的转速离心10min，移除上清液，下层浓缩部分即为aunps溶液；

s813：将pva粉末加入aunps溶液中搅拌至均匀混合，得到pva-au，可将其密封于离心管中保存。

需要说明的是，上述实施例中的各种溶液、粉末的参数以及转速参数、时间参数都可以根据需要进行不同的变换。

较佳实施例中，s813中的pva粉末与aunps溶液的质量体积比为5mg：2ml。

较佳实施例中，s813中的均匀混合之后还包括：对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。较佳地，预设ph值为5。

较佳实施例中，上述的调节ph值的方法为：加入稀hcl或稀hno3对均匀混合后的胶体的ph值进行调节至预设ph值。当然，不同实施例中，也可加入其它的酸性溶液或碱性溶液对ph值进行调节，此处不再赘述。

上述实施例用于测定酸度系数pka＞5类农药的原理为：(1)比色检测：pva-au胶体表面包覆柠檬酸根离子呈负电荷，静电斥力使pva-au均匀稳定地分散在弱酸性的体系中。pka＞5的农药分子在上述体系中会质子化并带有高正电荷，例如：福美双(pka＝7.82)分子含有2个叔胺基团，在弱酸性的体系中易质子化带正电荷。因此，在农药(pka＞5)的存在下，静电吸引力的作用导致pva-au由分散态变为聚集态。表现为pva-au胶体的等离子体共振波长向长波长方向移动，伴随pva-au胶体的颜色由酒红色变为紫色最终变为蓝色。在一定范围内，农药(pka＞5)的浓度越大，pva-au胶体等离子体共振波长的移动和胶体颜色的变化越明显。通过pva-au胶体等离子体波长的变化和胶体颜色的改变实现对农药(pka＞5)浓度的测量。(2)sers检测：pva-au胶体作为具有局域表面等离子体共振特性的纳米材料，可作为sers增强基底，它能够有效地放大目标分子的拉曼信号，适用于直接检测样品表面的目标分子。

此处公开的仅为本发明的优选实施例，本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，并不是对本发明的限定。任何本领域技术人员在说明书范围内所做的修改和变化，均应落在本发明所保护的范围内。