一种清热八味丸的检测方法与流程

本发明涉及一种蒙药的质量检测方法，特别涉及一种蒙药产品清热八味丸的质量检测方法，属于药物分析技术领域。

背景技术：

清热八味丸作为一种已有国家药品质量标准的蒙药制剂产品，由檀香、石膏、红花、苦地丁、瞿麦、胡黄莲、麦冬、人工牛黄制备而成，具有清热解毒的功效，用于炽热、血热、脏腑之热，肺热咳嗽，痰中带血，肝火肋痛等症。该药品在临床上应用多年，是国家基本药物，在清热解毒方面取得比较好的治疗效果。

现行质量标准中包括性状、显微鉴别、理化鉴别、检查、以及用薄层色谱法对人工牛黄的含量进行测定等项目，无对其他药用成分专属性强的薄层色谱鉴别和高效液相含量测定的方法。为更有效地控制产品质量，本检测方法增加了清热八味丸中苦地丁和胡黄连薄层鉴别，以及处方中的主要成分红花中的羟基红花黄色素a的高效液相色谱含量测定方法，为更好地控制清热八味丸的产品质量提供科学依据。

技术实现要素：

本发明对现有的清热八味丸质量标准进行了相应提高，在原质量标准基础上增加了苦地丁和胡黄连专属性较强的鉴别方法；增加了处方中的主要成分红花中的羟基红花黄色素a的含量测定方法，该方法精密度、稳定性、专一性、灵敏度较清热八味丸原质量标准均有所提高，进一步确保了产品质量安全、均一、稳定、有效、可控。

本发明的技术方案如下：

一种清热八味丸的质量检测方法,该方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：利用薄层色谱法对胡黄连、苦地丁和人工牛黄进行定性鉴别以及用高效液相色谱法羟基红花黄色素a的含量进行测定。

本发明的鉴别方法，采用以下方法：

胡黄连的鉴别：

供试品溶液的制备：取本品2～5g，采用研细方式，加10％硫酸溶液10～20ml，加热回流10～30min，放冷，用三氯甲烷萃取2次，每次10～15ml，合并三氯甲烷液，浓缩至1～3ml，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取胡黄连对照药材0.8～1.5g，加10％硫酸溶液10～20ml，加热回流10～30min，放冷，用三氯甲烷萃取2次，每次10～15ml，合并三氯甲烷液，浓缩至1～3ml，作为对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取香草酸对照品、肉桂酸对照品适量，分别加三氯甲烷制成每1ml含1.8～2.5mg的溶液，作为对照品溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5～15μl、对照药材溶液、对照品溶液各3～8μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以3～8：3～8：0.1正己烷-乙醚-冰乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

苦地丁的鉴别：

供试品溶液的制备：取本品2～5g，采用研细方式，加浓氨水0.8～1.5ml浸润，加三氯甲烷15～25ml，放置8～15h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.8～1.5ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取苦地丁对照药材0.8～1.5g，加浓氨水0.8～1.5ml浸润，加三氯甲烷15～25ml，放置8～15h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2ml使溶解，作为对照药材溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以5～10：1～3：1环己烷-三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾溶液；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点。

本发明的含量测定方法，羟基红花黄色素a的含量测定，步骤如下：

供试品溶液的制备：取本品粉末，置具塞锥形瓶中，加入20～30％甲醇溶液，称定重量，超声处理，再称定重量，用20％～30％甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，即得。

对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素a对照品适量，加20～30％甲醇水溶液制成每1ml含0.10～0.15mg对羟基红花黄色素的溶液，即得。

含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各8～15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5～15：1：30～50的甲醇-乙腈-0.7％磷酸为流动相；检测波长为380～420nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温30～40℃，进样量5～15μl。

优选的，本发明的含量测定方法，羟基红花黄色素a的含量测定，步骤如下：

高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体选自以下规格中的一种：5μm250mm×4.6mm、5μm150mm×4.6mm；以5～15：1：30～50的甲醇-乙腈-0.7％磷酸为流动相；检测波长为380～420nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温30～40℃，进样量5～15μl。

供试品溶液的制备：取本品粉末约1.5～2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20％～30％甲醇40～60ml，称定重量，超声功率300w，频率50khz，处理30～60分钟，放冷至室温，再称定重量，用20％～30％甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素a对照品适量，精密称定，加20～30％甲醇水溶液制成每1ml含0.10～0.15mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各8～15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明含量测定方法的验证：

1.仪器与试药

岛津lc-20at液相色谱仪；labsolutions工作站；紫外检测器；对照品：羟基红花黄色素a对照品(中国食品药品检定研究院，编号111637-201810，含量93.1％)；供试品三批(批号分别为1806040、1808044、1806080)；甲醇、乙腈为色谱纯；水为高纯水。

2.测定波长的选择

参照《中国药典》2015年版一部“红花”项下的规定，选用403nm作为检测波长。

3.色谱条件

色谱柱：gracec18柱(250mm×4.6mm，5μm)及thermohypersil柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：参照《中国药典》2015年版一部药材“红花”含量测定项下的流动相比例，样品中羟基红花黄色素a较早出峰，保留时间较小，调整流动相比例至甲醇-乙腈-0.7％磷酸(9:1:40)，羟基红花黄色素a与其它成分达到较好的分离，并具适合的保留时间，但拖尾现象较严重，在0.7％磷酸溶液中加入1.5％三乙胺后，可有效解决色谱峰拖尾现象。流速1ml/min；柱温35℃；进样量10μl。

4.专属性试验

供试品溶液的制备：取本品粉末约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25％甲醇50ml，称定重量，超声功率300w，频率50khz，处理40分钟，放冷至室温，再称定重量，用25％甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素a对照品适量，精密称定，加25％甲醇水溶液制成每1ml含0.13mg的溶液；

阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红花外的其他药材，根据制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺红花的阴性样品溶液。根据含量测定法分析，空白样品色谱图在红花峰保留时间上没有干扰峰。结果表明，阴性无干扰。色谱图见图3，方法的专属性好。

5.线性关系考察

精密称取羟基红花黄色素a对照品20mg，置100ml容量瓶中，加25％甲醇稀释至刻度，得浓度为200μg/ml的浓溶液，再精密量取5ml浓溶液，置于10ml容量瓶中，加25％甲醇稀释至刻度。精密吸取1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，分别注入液相色谱仪中，记录个图谱的羟基红花黄色素a峰面积积分值(y)。以进样量(x:μg)对峰面积积分值(y)进行回归分析。回归方程为y＝3230019.26140614x+15945.28797950，r2＝0.9999。结果显示，羟基红花黄色素a在0.08877mg～1.77542mg范围内于峰面积积分值呈良好线性关系。结果见表1和图4。

表1羟基红花黄色素a含量线性关系考察结果

6.稳定性试验

取本品2.0g，按“供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液，分别于0h、3h、6h、12h、24h进样，记录峰面积积分值。结果见表2。

表2稳定性试验结果

表2的结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

7.精密度试验

取本品2.0g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液。精密吸取10μl注入液相色谱仪，连续进样6次，测得羟基红花黄色素a峰面积积分值。结果见表3。

表3供试品精密度试验结果

表3的结果表明，rsd为0.8％，小于2.0％，说明供试品溶液测定的精密度良好。

8.加样回收实验

精密称取供试品1.0g，共9份，分别编号1～9。其中2号精密加入用25％甲醇配置的羟基红花黄色素a对照品溶液(浓度为0.187405mg/ml)5ml，1、3号各精密加入用25％甲醇配置的羟基红花黄色素a对照品溶液(浓度为0.1775417mg/ml)5ml，4、5、6号各加入对照品溶液(浓度为0.1775417mg/ml)10ml，7、8、9号各精密加入对照品溶液(浓度为0.1775417mg/ml)15ml。按“供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液，精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算加样回收率。结果见表4。

表4加样回收试验结果

表4的结果显示，rsd为0.7％，小于2.0％，平均回收率92.01％，本发明羟基红花黄色素a含量测定具有较好的回收率，准确度好。

9.柱耐用性试验

为了考察不同型号的色谱柱测定结果对实验的影响，用2种型号的色谱柱进行实验，结果见表5。

表5不同色谱柱的耐用性试验结果

结果表明，不同厂家色谱柱进行含量测定，相对偏差小于2.0％，本发明羟基红花黄素色a含量测定方法耐用性良好。

10.样品测定

分别选取三批样品(批号：1806040、1808044和1806080)，按“供试品溶液的制备”项下的方法制备溶液。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，进样分析，记录色谱图，计算含量，结果见表6。

表6样品中羟基红花黄色素a含量测定结果

按《中国药典》2015年版一部“红花”项下有关规定，红花药材中含羟基红花黄色素a不得少于1.0％。根据配方中红花的占比，规定本品每1g含红花以羟基红花黄色素a计，不得少于1.0mg/g。

本发明的有益效果在于：本发明所提供的质量检测方法是通过大量具体创造性实验筛选后得到的，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性好，且方法简便快捷、经济实用、结果快速。含量测定方法中通过对供试品处理方法及色谱条件的考察，证明本方法具有良好的重复性、稳定性、专属性及耐用性。该含量测定方法可有效的对产品进行质量分析，保证了该产品的质量稳定性。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1从左到右：胡黄连阴性样品、香草酸对照品、肉桂酸对照品、胡黄连对照药材、样品(1806040)、样品(1806080)、样品(1808044)；

图2从左到右：苦地丁阴性样品、苦地丁对照药材、样品(1808044)、样品(1806080)、样品(1806040)；

图3专属性试验色谱图：1、阴性对照，2、对照品，3、供试品；

图4羟基红花黄素色a标准曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1胡黄连的鉴别：

供试品溶液的制备：取本品3g，采用研细方式，加10％硫酸溶液15ml，加热回流15min，放冷，用三氯甲烷萃取2次，合并三氯甲烷，浓缩至2ml，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取胡黄连对照药材1g，加10％硫酸溶液15ml，加热回流15min，放冷，用三氯甲烷萃取2次，合并三氯甲烷，浓缩至2ml，作为对照药材溶液。

对照品溶液的制备：取香草酸对照品、肉桂酸对照品适量，分别加三氯甲烷制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10μl、对照药材溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以5：5：0.1正己烷-乙醚-冰乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见附图1。

实施例2苦地丁的鉴别：

供试品溶液的制备：取本品3g，采用研细方式，加浓氨水1ml浸润，加三氯甲烷20ml，放置10h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取苦地丁对照药材1g，加浓氨水1ml浸润，加三氯甲烷20ml，放置10h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以7：2：1环己烷-三氯甲烷-甲醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾溶液；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见附图2。

实施例3羟基红花黄色素a含量测定

高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以9：1：40的甲醇-乙腈-0.7％磷酸为流动相；检测波长为403nm；流速1ml/min；柱温35℃，进样量10μl。

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加入25％甲醇溶液适量，超声功率300w，频率50khz处理40min，放冷至室温，加25％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取羟基红花黄色素a对照品适量，精密称定，加25％甲醇水溶液制成每1ml含0.13mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

需要说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。