基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术：

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年导致70万人死亡。如果不采取行动制止这一全球性威胁，预计到2050年全球将有1000万人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。

目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、pcr技术等。这些传统的沙门氏菌检测方法检测周期长，工序繁琐，设备昂贵，远远不能满足要求。因此，急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。近几年，dna生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注。其中荧光技术具有灵敏度高、特异性强、价格低廉、无需样品预处理等显著的优势，在生物学、医学等领域中越来越受到人们的重视。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于无酶荧光信号传导的检测沙门氏菌的生物传感器。

本发明的另一目的是提供一种上述生物传感器在检测沙门氏菌中的应用与方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测沙门氏菌的生物传感器，包括发夹探针hap、复合探针s、核酸链s2、核酸链c、发卡探针h1、发卡探针h2、发卡探针h3、半胱氨酸、血红素、沙门氏菌和缓冲液；

所述的hap碱基系列如seqno.1所示；

所述的s0碱基系列如seqno.2所示；

所述的s1碱基系列如seqno.3所示；

所述的s2碱基系列如seqno.4所示；

所述的h1碱基系列如seqno.5所示；

所述的h2碱基系列如seqno.6所示；

所述的h3碱基系列如seqno.7所示；

所述的c碱基系列如seqno.8所示。

本发明中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过无酶辅助的等温放大方式来实现信号的放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是90min。

所述的检测沙门氏菌的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）复合探针s的构建；

（2）dna银纳米簇的合成（agncs-dna）；

（3）均相反应：将沙门氏菌与发夹探针hap加入到均相中，同时加入复合探针s、核酸链s2、h1、h2、h3、agncs-dna半胱氨酸、血红素、缓冲液，混和均匀后孵育；

（4）荧光仪检测荧光强度。

所述的步骤（1）复合探针s的构建步骤如下：

将灭菌水、10×pb、s0探针和s1探针加入到预先准备好的灭菌的ep管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。

所述的步骤（2）dna银纳米簇的合成（agncs-dna）操作步骤如下：

将15μl的100μm核酸链c和73μl的20mmpb（ph7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；

30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得。

所述的步骤（3）均相反应操作步骤如下：

将3μl沙门氏菌（5.0×10⁵cfu/ml）、发夹探针hap（1.5μl，500nm）、复合探针s（3μl，1μm）、核酸链s2（3μl，1μm）、h1（3μl，1μm）、h2（3μl，1μm）、h3（3μl，1μm）、agncs-dna（14μl，4μm）、半胱氨酸1μm、血红素（3μl，1μm）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。

所述的步骤（4）荧光仪设置激发波长为570nm。

所述的生物传感器用于检测食品和水中的沙门氏菌。

本申请所用到的序列为：

hap:5’-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagattggcattactat

gggtctcactatg-3’

s0:5’-aaaagaacccatagtgagacccatgaacccatagtgagacccatagtaatg

cc-3’

s1:5’-atgggtctcactatgggttcaacg-3’

s2:5’-gtctcactatgggttcatgggtctcactatgg-3’

h1:5’-tgggtagggcgggtcgttgaacccatagtgagacccatatgggtcaaga

catgggtctcactatgggt-3’

h2:5’-tgggtagggcgggtagtgagacccatgtcttgacccatatgggttcaac

gatgggtcaagacatgggt-3’

h3:5’-tgggtagggcgggtgtcttgacccatcgttgaacccatatgggtctcact

atgggttcaacgatgggt-3’

c:5’-cccccccccccc-3’

其中发卡探针hap黑色斜体部分是沙门氏菌的适配体序列，发卡探针h1、h2、h3黑色加粗字体是劈开的g四连体序列。将s0探针、s1探针安1:2杂交合成复合探针s，当目标物存在时，目标物和适配体特异性结合，从而将hap的发夹结构打开，打开的hap可以绑定复合探针s的末端立足点区域，将s1从复合探针s上置换下来，同时暴露第二个立足区域，核酸链s2通过暴露的立足区域与其杂交，进一步将另一条s1及打开的hap置换下来，置换下来的打开的hap进行下一轮循环，进而得到大量s1，置换下来的s1可打开h1，打开的h1继续打开h2，打开的h2又可进一步打开h3，打开的h3又可将s1置换下来，实现了催化发夹自组装放大（cha），同时使得形成g-四联体的序列暴露出来，在存在血红素时形成g-四联体/血红素dna酶。运用g-四联体/血红素类辣根过氧化物酶的催化性能来将半胱氨酸氧化成胱氨酸，无法实现半胱氨酸与银簇之间的通过金硫键的电荷转移，从而调控荧光信号传导，从而实现沙门氏菌的定量检测。

该发明的检测方式是荧光法检测，利用支点区域介导的链置换循环放大和cha放大功能，产生大量g-四联体dna酶，实现对半胱氨酸的氧化，使得荧光强度的显著变化。通过检测溶液的荧光强度进行目标物的检测。

本发明利用了核酸适配体的特异型识别，实现了对目标物沙门氏菌的高特异性检测；利用支点区域介导的链置换循环放大，产生大量二级产物s1；利用cha放大功能，不断地产生g-四联体dna酶，实现对半胱氨酸的氧化，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物沙门氏菌的超灵敏性检测；该传感器的反应条件温和，反应速度快；与其他光学检测手段相比，该检测方法操作简便、检测周期短；检测过程在均相中实现的，降低了操作的复杂程度；无需酶参与有效的降低了生物传感器的工艺成本，适用于产业化中低成本的要求。

本发明的有益效果：

1、检测限低

利用了核酸适配体的特异型识别，利用适配体与沙门氏菌的结合实现了对目标物的高特异性检测；利用支点区域介导的链置换循环放大，实现了hap的循环利用，同时产生大量二级产物s1，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；利用cha放大功能，不断地产生g-四联体dna酶，有效地提高了传感器的灵敏度；检测线可达到0.45。

2、方法简单，性能稳定

该传感器的构建仅需一步，有效地避免了多步加入样品可能带来的污染，同时具有操作简便、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。

3、检测食品和水中沙门氏菌

制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。适用于食品安全及水体中沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1h1浓度优化检测结果图；

图3为实施例2血红素浓度优化检测结果图

图4为实施例3反应时间优化检测结果图。

图5为实施例4检测沙门氏菌的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针s的合成操作步骤如下：

将18μl灭菌水、3μl10×pb、3μl100μm的s0探针和6μl100μm的s1探针加入到预先准备好的灭菌的ep管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。

dna银纳米簇的合成（agncs-dna）操作步骤如下：

将15μl的100μm核酸链c和73μl的20mmpb（ph7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag+与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得；

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

将3μl沙门氏菌（5.0×10⁵cfu/ml）、发夹探针hap（1.5μl，500nm）、复合探针s（3μl，1μm）、核酸链s2（3μl，1μm）、h1（终浓度分别为0.4μm，0.6μm，0.8μm，1.0μm，1.2μm，1.4μm）、h2（3μl，1μm）、h3（3μl，1μm）、agncs-dna（14μl，4μm）、半胱氨酸1μm、血红素（3μl，1μm）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。

荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：

将均相反应后的溶液（30μl）稀释至100μl，用荧光仪在635nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为570nm，发射波长为635nm，检测范围570nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着h1的浓度增大而减小，当浓度超过1.0μm后，荧光强度趋于稳定。所以h1的最佳终浓度为1.0μm。

实施例2

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针s的合成操作步骤如下：

将18μl灭菌水、3μl10×pb、3μl100μm的s0探针和6μl100μm的s1探针加入到预先准备好的灭菌的ep管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。

dna银纳米簇的合成（agncs-dna）操作步骤如下：

将15μl的100μm核酸链c和73μl的20mmpb（ph7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag+与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得；

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

将3μl沙门氏菌（5.0×10⁵cfu/ml）、发夹探针hap（1.5μl，500nm）、复合探针s（3μl，1μm）、核酸链s2（3μl，1μm）、h1（3μl，1μm）、h2（3μl，1μm）、h3（3μl，1μm）、agncs-dna（14μl，4μm）、半胱氨酸1μm、3μl不同浓度血红素（终浓度分别为0.01μm，0.05μm，0.1μm，0.5μm，1μm，5μm，10μm）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。

荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：

将均相反应后的溶液（30μl）稀释至100μl，用荧光仪在635nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为570nm，发射波长为635nm，检测范围570nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着血红素的浓度增大而减小，当浓度超过1.0μm后，荧光强度趋于稳定。所以血红素的最佳终浓度为1.0μm。

实施例3

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针s的合成操作步骤如下：

将18μl灭菌水、3μl10×pb、3μl100μm的s0探针和6μl100μm的s1探针加入到预先准备好的灭菌的ep管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。

dna银纳米簇的合成（agncs-dna）操作步骤如下：

将15μl的100μm核酸链c和73μl的20mmpb（ph7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag+与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得；

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

将3μl沙门氏菌（5.0×10⁵cfu/ml）、发夹探针hap（1.5μl，500nm）、复合探针s（3μl，1μm）、核酸链s2（3μl，1μm）、h1（3μl，1μm）、h2（3μl，1μm）、h3（3μl，1μm）、agncs-dna（14μl，4μm）、半胱氨酸1μm、血红素（3μl，1μm）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴30min，45min，60min，75min，90min，105min，120min。

荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：

将均相反应后的溶液（30μl）稀释至100μl，用荧光仪在635nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为570nm，发射波长为635nm，检测范围570nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应时间的延长而减小，当反应时间超过90min后，荧光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应时间为90min。

实施例4

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

复合探针s的合成操作步骤如下：

将18μl灭菌水、3μl10×pb、3μl100μm的s0探针和6μl100μm的s1探针加入到预先准备好的灭菌的ep管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20℃备用。

dna银纳米簇的合成（agncs-dna）操作步骤如下：

将15μl的100μm核酸链c和73μl的20mmpb（ph7.0）缓冲液加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag+与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上即得；

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

将3μl沙门氏菌（5.0×10⁵，1.0×10⁵，5.0×10⁴，1.0×10⁴，5.0×10³，1.0×10³，5.0×10²，1.0×10²，50，10cfu/ml）、发夹探针hap（1.5μl，500nm）、复合探针s（3μl，1μm）、核酸链s2（3μl，1μm）、h1（3μl，1μm）、h2（3μl，1μm）、h3（3μl，1μm）、agncs-dna（14μl，4μm）、半胱氨酸1μm、血红素（3μl，1μm）、缓冲液加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴90min。

荧光仪检测荧光强度主要步骤如下：

将均相反应后的溶液（30μl）稀释至100μl，用荧光仪在635nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为570nm，发射波长为635nm，检测范围570nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着沙门氏菌浓度的增大而减小，当浓度超过5.0×10⁵cfu/ml后，荧光强度趋于稳定。所以沙门氏菌的最佳终浓度为5.0×10⁵cfu/ml。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>济南大学

<120>基于核酸适配体检测沙门氏菌的生物传感器及其制备方法和应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>66

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>1

agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagattggcattactatgggtctc60

actatg66

<210>2

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>2

aaaagaacccatagtgagacccatgaacccatagtgagacccatagtaatgcc53

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>3

atgggtctcactatgggttcaacg24

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>4

gtctcactatgggttcatgggtctcactatgg32

<210>5

<211>68

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>5

tgggtagggcgggtcgttgaacccatagtgagacccatatgggtcaagacatgggtctca60

ctatgggt68

<210>6

<211>68

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>6

tgggtagggcgggtagtgagacccatgtcttgacccatatgggttcaacgatgggtcaag60

acatgggt68

<210>7

<211>68

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>7

tgggtagggcgggtgtcttgacccatcgttgaacccatatgggtctcactatgggttcaa60

cgatgggt68

<210>8

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>8

cccccccccccc12