一种测定含银敷料银离子释放的体外模型及方法与流程

本发明涉及用于敷料抗菌性能的评价研究模型及方法领域，具体是一种测定含银敷料银离子释放的体外模型及方法。

背景技术：

创面也称为创口或者创伤，是正常皮肤(组织)在外界致伤因素(如外科手术、热、低温等)外部作用，以及机体内在因素(如局部血液供应障碍)等作用下导致的损害。常伴有皮肤和人体组织损伤和连续性破坏完整性的破坏。根据愈合过程，可分为急性创面(切割伤、挫裂伤、手术创面等外伤，通常无并发症)和慢性创面(有糖尿病溃疡、静脉性小腿溃疡，创口愈合缓慢、延迟或停滞)。创口感染是造成创口延迟不愈的一个重要原因。

创面的正确处理是外科手术治疗成败的关键,而创面良好的愈合是创伤后机体功能康复的前提。加快创面愈合的研究中，对创面敷料的开发研制尤其重要。

敷料是覆盖于创面，为创面提供机械保护屏障，用于吸收或引流创口分泌物，从而控制创面的微生物环境，能直接或间接促进创口愈合。医用敷料种类繁多，早期有纱布、棉垫等传统敷料。近年来随着对“湿润创口愈合”理论的认可,以及各类新型高分子材料的快速发展,各类合成敷料、生物敷料等多种功能化、多样化的新型敷料得到广泛应用，典型代表各类泡沫敷料、藻酸盐敷料。

各类新型敷料目前临床上具有各自的特点，其中含银敷料由于其良好的抗感染作用已在国内得到广泛临床应用，银离子可以添加在水凝胶、藻酸盐等各种敷料中，能显著提高创口面积减少率和创口痊愈率。尤其适用于中到大量渗出液创面，能维持创口湿性环境，减少慢性感染创口细菌负载的作用。敷料中的银离子具有对细菌、真菌和病毒广谱抗菌特性，与菌体蛋白表面的负电荷结合，改变菌体结构，影响dna复制，杀灭细菌、真菌及其他病原体,减轻创口组织的炎症反应，促进创口愈合。

含银敷料以敷料为主，添加含银物质释放银离子产生抗菌作用。一般通过物理吸附或离子交换吸附作用等方法,将含银物质负载于敷料基材,用于患者创口后，通过创口渗出液溶解，释放银离子而获得抗菌性。理想的含银敷料中的银离子能够匀速、持续释放。由于敷料基材的材料、组成及结构型式多样，含银物质的化学结构、含银量及其在基材中分布的均匀性，决定银离子释放量、释放速率及释放曲线，这些因素将影响银离子在体内吸收及分布代谢，反映含银敷料抗菌性能有效作用程度。因此，怎样科学有效评价以上影响因素，至关重要。

对于含银敷料抗菌性能的评价研究，可通过体内和体外试验，评价产品的抗菌机理和有效性。体内试验如临床评价及动物试验，通过试验动物人为损伤创面的观察；或敷料临床试验时，通过患者的创面愈合症状，来评价敷料的抗菌性能。这两种方法均存在成本高，周期长，且因试验对象的个体原因及创面差异等因素，重复性差，不能进行客观有效的评价。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足，提供一种测定含银敷料银离子释放的体外模型及方法，能够模拟不同创口类型，通过测量含银敷料试样与模拟创口渗出液接触后，不同时间点内定量测定的银离子释放量及释放曲线的体外试验，科学直观反映出敷料产品中释放的银离子有效成分及累积离子量，动态评价含银敷料模拟临床使用状态下银离子的释放量，即敷料的抗菌性能，可有效评价含银敷料的安全性和有效性。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种测定含银敷料银离子释放的体外模型，包括试验杯和培养盘；所述试验杯包括固定连接的凸起部和凹陷部，所述凸起部的顶面高于凹陷部的顶面，所述试验杯的内部设有腔体，所述凹陷部的顶面设有与腔体连通的开口，所述凸起部上设有与腔体连通的加液口；所述培养盘上设有凹槽。

本发明的技术方案还有：所述凸起部呈圆筒状。

本发明的技术方案还有：所述凸起部呈矩形平板状。

本发明的技术方案还有：还包括压块，所述压块用于将敷料试样压紧在开口或凹槽上。

本发明还提供了一种测定含银敷料银离子释放的方法，包括饱和状态下测定方法和不饱和状态下测定方法；

所述饱和状态下测定方法包括以下步骤：

1.1、对敷料试样进行预湿处理，使敷料试样吸收饱和状态试验液，所述饱和状态试验液为氯化钠和氯化钙的混合溶液；

1.2、将敷料试样覆盖在开口上并压紧固定；

1.3、由加液口向腔体内加入饱和状态试验液；

1.4、经过试验时间后，将试验杯内的饱和状态试验液取出，进行消解处理，然后用原子吸收法测定饱和状态试验液中的银离子浓度；

1.5、重复步骤1.4，测定不同试验时间点时饱和状态试验液中的银离子浓度；

所述不饱和状态下测定方法包括以下步骤：

2.1、配置不饱和状态试验液并置于凹槽中，不饱和状态试验液中含有纤维蛋白原、牛血清白蛋白(bsa)磷酸盐缓冲液和凝血酶，将培养盘置于37℃±2℃下1h，然后室温冷却1h，使纤维蛋白凝块形成并凝固，形成模拟创面；

2.2、根据需要，选择是否对敷料试样预湿及预湿程度，将敷料试样覆盖在模拟创面上并压紧固定，然后将培养盘置于一封闭容器中；

2.3、经过试验时间后，将模拟创面取出，进行消解处理，然后用原子吸收法测定不饱和状态试验液中的银离子浓度；

2.4、重复步骤2.3，测定不同试验时间点时不饱和状态试验液中的银离子浓度。

本发明的技术方案还有：

所述步骤1.5后还包括步骤1.6：分别以银离子释放量和试验时间点为横坐标和纵坐标，绘制饱和状态下含银敷料银离子体外试验释放曲线；

所述步骤2.4后还包括步骤2.5：分别以银离子释放量和试验时间点为横坐标和纵坐标，绘制不饱和状态下含银敷料银离子体外试验释放曲线。

本发明的技术方案还有：

所述预湿处理包括以下步骤：

3.1、对预湿前的敷料试样称重，得到敷料试样预湿前的质量；

3.2、将敷料试样放入带37℃±2℃水的烧杯中，将烧杯置于37℃干燥箱中保持30min，使敷料试样吸收水至饱和；

3.3、用镊子夹住敷料试样的一角，悬垂30s后称重，得到敷料试样预湿后的质量，根据两次称重之差计算敷料试样的最大液体吸收量；

3.4、根据不同试验目的及敷料试样适用的创口类型，用敷料试样的最大液体吸收量算出不同湿度程度，使敷料试样吸收预期量的饱和状态试验液或不饱和状态试验液。

本发明的技术方案还有：所述饱和状态试验液的温度为37℃±2℃，以模拟人体创面伤口温度。

本发明的技术方案还有：所述饱和状态试验液中的钠离子浓度为135-145mmol/l，所述饱和状态试验液中的钙离子浓度为2.25-2.75mmol/l。

本发明的技术方案还有：所述不饱和状态试验液中的纤维蛋白原的浓度为30mg/ml。

相对于现有技术，本发明测定含银敷料银离子释放的体外模型及测定方法的有益效果为：(1)运用本发明的试验杯和培养盘，可分别模拟临床中不同类型的创面类型(饱和状态和不饱和状态)，最大程度模拟创口渗出液量少量及大量的不同状态，最接近临床上含银敷料中银离子的实际释放情况；

(2)通过该模型试验得出含银敷料银离子体外试验释放曲线，能科学直观反映出敷料产品中释放的银离子有效成分、累积离子量，可动态评价敷料模拟临床不同使用时期银离子的释放量，从而反映出含银敷料的抗菌性能，并由此可有效评价含银敷料的安全性和有效性；

(3)与动物体内试验或临床患者试验相比较，本发明建立的体外试验模型，评价成本低、试验周期短、重复性好、数据结果直观、清晰，克服了动物体内试验客观影响因素多，重复性差，成本高且不能定量评价等诸多不利因素；

(4)本发明建立的体外试验模型，尤其适用于敷料开发研制阶段，在敷料基材的选择，含银物质的化学结构、添加量、与基材作用方式及其分布的均匀性等方面，都可使用本模型进行比较试验，根据预期值合理调整工艺及产品组份配方；

(5)适用于不同含银敷料产品间的抗菌性能进行横向比较。

附图说明

图1为实施例一中试验杯的使用状态参考图。

图2为实施例一中试验杯的立体图。

图3为实施例一中培养盘的使用状态参考图。

图4为实施例二中试验杯的立体图。

图中：1、试验杯，2、培养盘，3、凸起部，4、凹陷部，5、腔体，6、开口，7、加液口，8、凹槽，9、压块，10、敷料试样，11、饱和状态试验液，12、模拟创面。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面根据附图对本发明具体实施方式作进一步说明。

实施例一

如图1-图3所示，一种测定含银敷料银离子释放的体外模型，包括试验杯1、培养盘2和压块9。

试验杯1适用于模拟有大量渗出液时伤口创面，是评价敷料吸收创面渗液后处在达到吸收饱和状态(即湿态下)的银离子释放的模型，可最大程度模拟临床创面实际状态。试验杯1包括固定连接的凸起部3和凹陷部4，如图2所示，凸起部3呈圆筒状，凸起部3的顶面高于凹陷部4的顶面，试验杯1的内部设有腔体5，凹陷部4的顶面设有与腔体5连通的开口6。凸起部3的顶部设有与腔体5连通的加液口7，用于向腔体5内加入饱和状态试验液11，加液口7处设有盖板，试验时防止液体挥发。试验时，敷料试样10会吸收不饱和状态试验液11，导致腔体5内的液面降低，由于凸起部3的顶面高于凹陷部4的顶面，因此能够使不饱和状态试验液11与敷料试样10保持接触。试验杯1在使用前需要在70％酒精振摇清洗，干燥至少1h。

培养盘2适用于模拟有少量、中量渗出液的伤口创面，是评价敷料吸收创面渗液后处在未饱和状态下(即干态或半干态)的银离子释放的模型。通过建立一个创面模型(woundmodel)，即一种模拟创面的纤维蛋白凝块，用于评价敷料与创面的接触，可最大程度模拟临床创面实际状态。如图3所示，培养盘2直径为40mm，材质为聚甲醛或聚苯乙烯，培养盘2上设有凹槽8，凹槽8的直径为20mm、深度为3mm。

压块9采用50mm×50mm×5mm的不锈钢块，重量约为98g，用于将敷料试样10压紧在开口6或凹槽8上。

本实施例还提供了一种测定含银敷料银离子释放的方法，包括饱和状态下测定方法和不饱和状态下测定方法；

饱和状态下测定方法包括以下步骤：

1.1、采用圆形的敷料试样10，对敷料试样10进行预湿处理，使敷料试样10吸收饱和状态试验液11，饱和状态试验液11为氯化钠和氯化钙的混合溶液，其中钠离子浓度为142mmol/l，饱和状态试验液11中的钙离子浓度为2.5mmol/l；

1.2、将敷料试样10覆盖在开口6上并用压块9压紧固定，以消除敷料试样10与试验杯1之间的气隔并防止敷料试样10位移；

1.3、由加液口7向腔体5内加入饱和状态试验液11；

1.4、经过试验时间后，将试验杯1内的饱和状态试验液11取出，进行消解处理，然后用原子吸收法测定饱和状态试验液11中的银离子浓度；

1.5、重复步骤1.4，测定不同试验时间点(如1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h等)时饱和状态试验液11中的银离子浓度；

1.6、分别以银离子释放量和试验时间点为横坐标和纵坐标，绘制饱和状态下含银敷料银离子体外试验释放曲线。

不饱和状态下测定方法包括以下步骤：

2.1、配置不饱和状态试验液并置于凹槽8中，不饱和状态试验液中含有纤维蛋白原、牛血清白蛋白(bsa)磷酸盐缓冲液和凝血酶，具体的，取纤维蛋白原3g，加入到牛血清白蛋白(bsa)磷酸盐缓冲液中，使纤维蛋白原浓度为30mg/ml，再取该溶液10ml，加入到培养盘2中，然后加入凝血酶1ml，迅速混匀；将混合物置37℃±2℃下1h，然后室温冷却1h，使纤维蛋白凝块形成并凝固，即形成模拟创面。将培养盘置于37℃±2℃下1h，然后室温冷却1h，使纤维蛋白凝块形成并凝固，形成模拟创面12；

2.2、根据需要，选择是否对敷料试样10预湿及预湿程度，将敷料试样10覆盖在模拟创面12上并并用压块9压紧固定，然后将培养盘2置于一封闭容器中；

2.3、经过试验时间后，将模拟创面12取出，进行消解处理，然后用原子吸收法测定不饱和状态试验液中的银离子浓度；

2.4、重复步骤2.3，测定不同试验时间点(如1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h等)时不饱和状态试验液中的银离子浓度；

2.5、分别以银离子释放量和试验时间点为横坐标和纵坐标，绘制不饱和状态下含银敷料银离子体外试验释放曲线。

在上述测定含银敷料银离子释放的方法中，饱和状态试验液的温度为37℃±2℃，以模拟人体创面伤口温度。

在上述测定含银敷料银离子释放的方法中，预湿处理包括以下步骤：

3.1、取敷料试样10三片，对预湿前的敷料试样10分别称重，得到敷料试样10预湿前的质量；

3.2、将敷料试样10放入带37℃±2℃水的烧杯中，将烧杯置于37℃干燥箱中保持30min，使敷料试样10吸收水至饱和；

3.3、用镊子夹住敷料试样10的一角，悬垂30s后称重，得到敷料试样(10)预湿后的质量，根据两次称重之差计算敷料试样(10)的最大液体吸收量；

3.4、根据不同试验目的及敷料试样10适用的创口类型，用敷料试样10的最大液体吸收量算出不同湿度程度(如75％、50％、25％)，使敷料试样10吸收预期量的试验液。

不同类型的敷料，其吸收液体的能力不一样，如相同面积的敷料，吸收能力大的可吸收200ml液体，而吸收能力小的仅30-40ml左右，经预湿后，敷料吸水能力基本处于饱和，对试验液的吸收消耗就极少，也就是试验液的量基本不减少，保持不变,因此,预湿处理一是使敷料试样10处于模拟伤口环境，二是使试验时不同敷料试样10下的饱和状态试验液11的量保持一致。试验结果表明，预湿程度越高，敷料试样10的银离子释放量也越高。

通过试验可以得出对含银敷料的抗菌功能进行客观评价：

1、敷料产品声称的银离子含量与释放量没有相关性，即与抗菌性能的高低没有相关性；

2、不同敷料中银离子的释放量与抗菌性能有相关性，释放量越高，表明抗菌性能越好。

实施例二

如图4所示，不同于实施例一的是，凸起部3呈矩形平板状，凸起部3位于凹陷部4的两侧。

上面结合附图对本发明的实施例做了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。