吲达帕胺原料药中DCC和DCU含量的检测方法与流程

本发明涉及吲达帕胺原料药中杂质含量的检测方法，具体涉及一种吲达帕胺原料药中dcc和dcu含量的检测方法。
背景技术：
：吲达帕胺为磺胺类利尿药，具有利尿和钙拮抗作用，是一种强效、长效的降压药，临床上还用于充血性心力衰竭时水钠潴留的治疗。dcc(二环己基碳二亚胺)和dcu(二环己基脲)为吲达帕胺合成工艺中的残留物，目前国标hg/t5320-2018仅公开了dcc质量分数的测定方法，现有技术中并没有任何关于dcc和dcu含量的检测方法，更没有同时能够进行dcc和dcu含量的检测方法。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种吲达帕胺原料药中dcc和dcu含量的检测方法，该检测方法可以同时进行dcc和dcu含量的检测，检出限低、节省时间且检测结果准确。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：吲达帕胺原料药中dcc和dcu含量的检测方法，利用高效液相色谱法对吲达帕胺原料药中的dcc和dcu进行检测，包括以下步骤：(1)配制吲达帕胺原料药供试品溶液；(2)分别配制dcc对照品溶液、dcu的对照品溶液和dcc&dcu对照品溶液；(3)进样，按以下条件对步骤(1)供试品溶液和步骤(2)中的对照品溶液分别进行检测：色谱条件：流动相：乙腈-水；梯度洗脱：0-30min乙腈比例由10-40％逐渐升至90-98％；柱温为33-37℃；流速为1.4-1.6ml/min；检测波长为190-210nm；(4)将供试品dcc、dcu对应的峰面积与对照品溶液计算得到dcc、dcu的含量。其中，色谱柱为c18液相色谱柱。优选地，色谱柱为agelavenusilc18plus，4.6*200mm,5μm。优选地，色谱柱为agelavenusilxbpc18，4.6*200mm，5μm。其中，步骤(3)中色谱条件为：进样量为10μl。优选地，步骤(3)中色谱条件为：检测波长为205nm。优选地，步骤(3)中色谱条件为：梯度洗脱：0-30min乙腈比例由35％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm。其中，步骤(1)中吲达帕胺原料药供试品溶液的浓度为3-7mg/ml。其中，步骤(1)中dcc的浓度为5-10μg/ml，dcu的浓度为5-10μg/ml。1、本发明对色谱条件中的波长进行优化：优化时：色谱柱：agelavenusilc18plus，4.6*200mm,5μm；流速：1.5ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：0-30min乙腈比例由35％逐渐升至95％。取dcc、dcu对照品溶液在160-400nm波长范围内进行扫描，根据扫描所得色谱图可知，dcc、dcu的响应值在190-210nm范围内响应值较高，考虑到溶剂的末端吸收干扰，因此以波长在205nm时为最佳。2、本发明对色谱条件中的梯度洗脱条件进行优化：优化时：色谱柱：agelavenusilc18plus，4.6*200mm,5μm；流速：1.5ml/min；柱温：35℃；检测波长：205nm；进样量：10μl；流动相:乙腈-水。分别改变乙腈的起始比例为5％、10％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％，其中以乙腈起始比例为35％时，分离和保留时间为最佳。本发明检测吲达帕胺原料药中dcc和dcu的含量，dcc的线性范围在0.9279～14.8464μg/ml之间，检出限为0.4639μg/ml，平均回收率大于99.2％，dcu的线性范围在0.9336μg/ml～14.9372μg/ml之间，检出限为0.4668μg/ml，平均回收率大于102.4％。本发明所提供的吲达帕胺原料药中dcc和dcu含量的检测方法，使用的试剂毒性小，杂质干扰少，检测方法可靠稳定，对吲达帕胺原料药的质量控制具有重要意义。附图说明图1为实施例1中加标样品溶液的色谱图；图2为实施例2中加标样品溶液的色谱图；图3为实施例3中加标样品溶液的色谱图；图4为实施例4中加标样品溶液的色谱图；图5为实施例5中加标样品溶液的色谱图；图6为实施例6中编号为1的供试品溶液的色谱图；图7为实施例6中编号为2的供试品溶液的色谱图；图8为实施例6中编号为3的供试品溶液的色谱图；图9为实施例6中编号为4的供试品溶液的色谱图；图10为实施例6中对照品溶液的色谱图；图11为实施例6中dcc对照品溶液的色谱图；图12为实施例6中dcu对照品溶液的色谱图。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。1.仪器药品与试剂仪器：高效液相色谱(型号dionexultimate3000)试剂：乙腈(默克，ja076530)、dcc(tci，ag7ch-qn)、dcu(阿拉丁，h1809065)2.实验方法2.1供试品溶液的配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg至25ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。2.2dcc对照品溶液的配制：精密称取dcc对照品75mg至100ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为dcu对照品贮备液，再移取对照品贮备液1ml至100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度。2.3dcu对照品溶液的配制：精密称取dcu对照品75mg至100ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，作为dcc对照品贮备液，再移取对照品贮备液1ml至100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度。2.4dcc&dcu对照品溶液的配制：分别各移取1mldcc对照品贮备溶液和dcu对照品贮备溶液至同一100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度制得对照品溶液。实施例1流动相乙腈起始比例的确定加标样品溶液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为对照储备液。精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用上述对照储备液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由5％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl，结果见图1。结论：dcc未出峰实施例2流动相乙腈起始比例的确定加标样品溶液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为对照储备液。精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用上述对照储备液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由10％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl，结果见图2。结论：dcu、dcc均出峰，与其他杂质峰可达到完全分离。实施例3流动相乙腈起始比例的确定加标样品溶液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为对照储备液。精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用上述对照储备液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由25％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl，结果见图3。结论：dcu、dcc均出峰，与其他杂质峰可达到完全分离。实施例4流动相乙腈起始比例的确定加标样品溶液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为对照储备液。精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用上述对照储备液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由35％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl，结果见图4。结论：dcu、dcc均出峰，与其他杂质峰可达到完全分离。实施例5流动相乙腈起始比例的确定加标样品溶液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为对照储备液。精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用上述对照储备液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由45％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl，结果见图5。结论：dcu与相邻杂质峰未完全分离。实施例6分析方法验证结果如下：色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由35％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl。1.系统适用性：取dcc&dcu对照品溶液连续重复进样6次，记录色谱图峰面积，结果如下：表1系统适应性的验证结果2.专属性线性对照储备液的配制：精密称取dcc和dcu各75mg置于同一200ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，作为100％水平对照品溶液。加标样品溶液的配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg至25ml量瓶中，用上述100％水平对照品溶液溶解并稀释至刻度。分别取空白溶剂(乙腈)、dcc对照品溶液、dcu对照品溶液、dcc&dcu对照品溶液、加标样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如下：表2专属性的验证结果3、线性关系：线性对照储备溶液配制：精密称取dcc和dcu各75mg，置于同一200ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取线性对照储备溶液适量，按照下表配制不同浓度线性溶液，用乙腈稀释至刻度，摇匀。表3线性关系中各梯度溶液的配制水平线性储备溶液体积(ml)定容体积(ml)loq(12.5％)0.520025％120050％1100100％2100150％3100200％250分别取上述不同浓度的线性对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，分别以dcc和dcu浓度(μg/ml)作为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果如下：表4线性关系的验证结果4、准确度：本底样品溶液配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。加标样品溶液的配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg9份，置于25ml量瓶中，分别用50％、100％、200％水平线性溶液(见线性关系中的溶液配制表格)溶解并稀释至刻度，摇匀，每个水平平行配制3份。取dcc&dcu对照品溶液、本底样品溶液、加标样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算9份加标样品dcc、dcu的回收率，结果如下：表5准确度的验证结果5、重复性：精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml容量瓶中，用线性关系中的溶液配制表格中的100％水平对照溶液溶解并稀释至刻度，平行配制6份，作为加标样品溶液，计算dcc和dcu的回收率，结果如下：表6重复性的验证结果6、中间精密度：更换另一名实验员，在不同的日期精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用线性关系中的溶液配制表格中的100％水平对照溶液溶解并稀释至刻度，平行配制6份，作为加标样品溶液，计算dcc、dcu的回收率，结果如下：表7中间精密度的验证结果7、检测限：取dcc&dcu对照品溶液逐步稀释，并注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比约为3：1时的浓度即为检测限，结果如下：表8检测线的实验结果8、定量限：取dcc&dcu对照品溶液逐步稀释，并注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比约为10：1时的浓度即为定量限，结果如下：表9定量限的实验结果9、溶液稳定性：加标样品溶液的配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用线性关系中的溶液配制表格中的100％水平对照溶液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。取dcc&dcu对照品溶液及100％加标样品溶液室温放置，并在不同时间点进样，记录色谱图峰面积，结果如下：表10溶液稳定性的验证结果10、耐用性加标样品溶液的配制：精密称取吲达帕胺原料药125mg置于25ml量瓶中，用线性关系中的溶液配制表格中的100％水平对照溶液溶解并稀释至刻度，作为加标样品溶液。取上述加标样品溶液，分别改变色谱条件：柱温±2℃；流速±0.2ml/min；流动相起始比例±2％；色谱柱测试dcc加样回收实验结果，并将测定结果与标准条件比较，结果如下：表11耐用性的验证结果上表的分析结果：说明本发明所提供的方法符合ich方法学验证和中国药典2015版四部的相关指导原则要求，能够准确测定吲达帕胺原料药中的dcc、dcu含量，为该原料药的质量控制提供可靠的检测方法。实施例7色谱条件：色谱柱：agelavenusilc18plus4.6*200mm,5μm；流动相：乙腈-水梯度洗脱，0-30min乙腈比例由35％逐级升高至95％；柱温为35℃；流速为1.5ml/min；检测波长为205nm；进样量为10μl。取四种不同批次的吲达帕胺原料药配制成供试品溶液，分别编号为1-4，将上述四种供试品溶液和对照品溶液分别按照上述色谱条件进行进样检测，其中图6为编号为1的供试品溶液的色谱图，图7为编号为2的供试品溶液的色谱图，图8为编号为3的供试品溶液的色谱图，图9为编号为4的供试品溶液的色谱图，图10为dcc&dcu对照品溶液的色谱图，图11为dcc对照品溶液的色谱图，图12为dcu对照品溶液的色谱图，通过与对照品溶液中dcc、dcu物质峰面积的比较按照外标法计算得到供试品中dcc、dcu的含量，计算得到的dcc和dcu的含量结果如下表所示：表12不同批次吲达帕胺原料药中dcc、dcu的含量对比例气相色谱检测气相色谱条件：固定相为100％聚二甲基硅氧烷的毛细管柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm；载气为氮气；进样口温度为320℃；检测器温度为330℃；进样量为1μl；分流进样，分流比10：1；柱流速为1.5ml/min保持11.5min,以2ml/min升至3.5ml/min，保持15min；升温程序为初始温度50℃，保持2min，以40℃/min的速率升温至230℃，保持5min，再继续以40℃/min的速率升温至280℃，保持15min；按照实施例6准确度中的配制方法配制本底样品溶液、加标样品溶液。取对照品溶液、本底样品溶液、加标样品溶液，注入气相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算9份加标样品dcc、dcu的回收率，结果如下：通过分析气相色谱检测得到dcc和dcu回收率可以看出，dcc的回收率均不到80％、dcu的回收率绝大部分都不到80％。进一步的，二者的平均回收率更是远远低于90％，这表明使用气相色谱检测方法进行检测，其准确度达不到对吲达帕胺中dcc和dcu含量的检测要求。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12