一种分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法与流程

本发明涉及化合物检测
技术领域：
，具体涉及一种高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法。
背景技术：
：4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-c]吡啶盐酸盐是一种医药中间体，主要用于合成血小板凝结抑制剂如噻氯吡啶、氯吡格雷、普拉格雷等药物。为了提高药品生产的质量，按照药品生产规范及产品标准，如美国药典(usp)及欧洲药典(ep)的规定，需要对关键中间体4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的质量进行有效的分析和控制，分析4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的制备及降解过程，可能存在的几种杂质组分为：而目前，暂未见比较成熟的关于分析和检测4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的相关报道。现有技术：“科学技术与工程第13卷第30期(4,5,6,7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶的合成研究)”公开了hplc方法用的梯度洗脱，但文献中并未具体说明梯度洗脱程序，而且运用该文献方法不能将4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐与其有关物质完全分离开。因此，本领域需要提供一种分析4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的纯度，并可同时将4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质进行有效分离的方法，从而实现血小板凝结抑制剂类药物原料药及制剂的质量控制。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法，用以分析4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的纯度，并同时将4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质进行有效分离，从而实现血小板凝结抑制剂类药物原料药及制剂的质量控制。为实现上述目的，本发明提供了一种高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法，以体积比为25:75-5:95的有机相及25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相；所述有机相为甲醇或乙腈。具体地，该方法包括如下步骤：1)配制样品溶液：取4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐样品，用流动相溶解，配制成4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的样品溶液；2)取所述样品溶液注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，完成所述4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐样品的分离检测；其中，流动相为体积比为25:75-5:95的有机相与25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液。在本发明的一个实施方案中，所述高效液相色谱仪的流动相为体积比为25：75～5：95(优选为1:9)的有机相:25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液。在本发明的一个实施方案中，所述有机相为甲醇或乙腈。在本发明的一个优选的实施方案中，所述有机相为乙腈。本发明所述流动相能够很好的洗脱杂质，使主峰中杂质峰得到有效分离，各色谱峰之间具有良好的分离度。在本发明的一个实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲溶液的ph为2-4，优选为2.2。在该ph下，主峰和杂质峰峰形具有很好的对称性，各色谱峰之间具有良好的分离度。所述磷酸二氢钾缓冲溶液可市售购得，或可通过本领域的常规技术手段制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲溶液通过如下方法制备得到：精密称取磷酸二氢钾3.4g，加水1000ml，再加1ml三乙胺，调节ph，即得所述磷酸二氢钾缓冲溶液。在本发明的一个实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲溶液的ph可通过使用磷酸进行调节。在本发明的一个实施方案中，所述流动相的流速为0.2-1.0ml/min。优选为0.5ml/min。在该流速下，色谱峰出峰时间适宜，如果流速小于0.2ml/min，则分析时间过长，影响分析效率，如果流速大于1.0ml/min，则出峰时间过快，可能会导致部分杂质无法检出。在本发明的一个实施方案中，所述高效液相色谱仪的色谱柱为welchxb-c18(250mm×4.6mm，5μm)。在本发明的一个实施方案中，所述高效液相色谱仪的柱温为20-40℃，优选为30℃。在该柱温下，有利于峰形，又不至于出峰时间太早而影响分离度。如果温度小于20℃，则峰形很宽也不利于分离，如果温度大于40℃，则会导致出峰时间过早。在本发明的一个实施方案中，所述色谱图为在检测波长为210-240nm(优选为234nm)下记录的色谱图。在该检测波长下，各色谱峰均有优良的紫外吸收。在本发明的一个实施方案中，所述样品溶液的浓度为0.2±0.1mg/ml的4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的浓度。在本发明的一个实施方案中，步骤2)中所述样品溶液的进样量为10μl。在本发明的一个实施方案中，所述有关物质包括如下物质：在上述色谱条件下，能够在相对较短时间内准确对样品进行检测，具有灵敏度高、响应强、稳定性好、效率高的优点。通过本发明方法得到的色谱图，各杂质峰出峰形态好，能够清晰分辨上述各杂质情况。在本发明的一个优选的实施方案中，所述高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法包括如下步骤：1)配制样品溶液：取4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐样品，用流动相溶解，配制成4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的浓度为0.2±0.1mg/ml的样品溶液；2)取10μl所述样品溶液注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，完成所述4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐样品的分离检测；其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为welchxb-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为体积比为25:75-5:95的乙腈与25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液，其中，所述磷酸二氢钾缓冲溶液的ph为2-3；所述高效液相色谱仪的柱温为20-40℃；所述流动相的流速为0.2-1.0ml/min；检测波长为210-240nm。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法包括如下步骤：1)配制样品溶液：取4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐样品，用流动相溶解，配制成4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐的浓度为0.2mg/ml的样品溶液；2)取10μl所述样品溶液注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，完成所述4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐样品的分离检测；其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为welchxb-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为体积比为9:10的乙腈与25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液，其中，所述磷酸二氢钾缓冲溶液的ph为2.2；所述高效液相色谱仪的柱温为30℃；所述流动相的流速为0.5ml/min；检测波长为234nm。本发明方法具有如下优点：1、通过本发明方法得到的色谱图中各物质的峰形良好，能够清晰分辨各杂质情况；2、通过本发明方法，4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰可以与原料和杂质峰达到良好分离。3、通过本发明方法，能够稳定有效地分析检测4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐及其杂质。4、通过本发明方法，各色谱峰均有优良的紫外吸收，灵敏度高、响应强。5、通过本发明方法，色谱峰出峰时间适宜，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐及其杂质均能够高效的检测出来，效率高。附图说明图1为实施例1中样品溶液的高效液相色谱图。图2为实施例2中样品溶液的高效液相色谱图。图3为实施例3中样品溶液的高效液相色谱图。图4为实施例4中样品溶液的高效液相色谱图。图5为对比例1中样品溶液的高效液相色谱图。图6为比较例1中样品溶液的高效液相色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明如无特殊说明，实施例中流动相的各物质的比例为体积比。实施例1：4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的分离检测本实施例提供了一种高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法，所述方法包括如下步骤：1)称取4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐样品20mg，置于100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；2)取样品溶液，按如下色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图；色谱条件：高效液相色谱仪：戴安：ultimate3000；色谱柱：welchxb-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈:25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液(精密称取磷酸二氢钾3.4g，加水1000ml，再加1ml三乙胺，用磷酸调ph至2.2)＝10:90；流速：0.5ml/min；检测波长：234nm；柱温：30℃；进样体积：10μl。图1为最优选条件的hplc图，图1中1号峰为杂质a，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐，3号峰为2-噻吩乙胺，4号峰为杂质c，5号峰为杂质b，6号峰为杂质d。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰可以与原料和杂质分离良好，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在10min左右。实施例2本实施例按照与实施例1相同的方法进行4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的分离检测，区别仅在于，本实施例的柱温为35℃。图2柱温为35℃时的hplc图，图2中1号峰为杂质a，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐，3号峰为2-噻吩乙胺，4号峰为杂质c，5号峰为杂质b，6号峰为杂质d。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰可以与原料和杂质分离良好，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在9.7min左右。实施例3本实施例按照与实施例1相同的方法进行4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的分离检测，区别仅在于，本实施例的流动相的流速为：1.0ml/min。图3流动相流速为1.0ml/min时的hplc图，图3中1号峰为杂质a，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐，3号峰为2-噻吩乙胺+杂质c，4号峰为杂质b，5号峰为杂质d。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰不能与原料和杂质达到良好分离，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在5.7min左右。实施例4本实施例按照与实施例1相同的方法进行4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的分离检测，区别仅在于，本实施例的流动相为：乙腈:25mmol/l磷酸二氢钾缓冲溶液＝20:80。图4乙腈与缓冲液比例为20:80时的hplc图，图4中1号峰为杂质a，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐+2-噻吩乙胺，3号峰为杂质c，4号峰为杂质b，5号峰为杂质d。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰不能与原料和杂质达到良好分离，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在6.7min左右。对比例1本实施例按照与实施例1相同的方法进行4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的分离检测，区别仅在于，本实施例的磷酸二氢钾缓冲溶液的ph为7.0；流动相的流速为1.0ml/min。图5缓冲溶液ph为7.0，流动相流速为1.0ml/min时的hplc图，图5中1号峰为2-噻吩乙胺，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐，3号峰为杂质a，4号峰为杂质b。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰可以与原料和杂质达到良好分离，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在12.7min左右。但各色谱峰拖尾严重，而且基线不平稳，不利于色谱峰的积分。比较例1本比较例提供了一种高效液相色谱分离检测4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]吡啶盐酸盐及其有关物质的方法，所述方法包括如下步骤：1)称取4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐20mg，置于100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；2)取样品溶液，按以下色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图：色谱条件：高效液相色谱仪：戴安：ultimate3000；色谱柱：welchxb-c18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：流动相a磷酸二氢钠缓冲溶液(精密称取磷酸二氢钠6.0g，加水1000ml，再加1ml三乙胺，用磷酸调ph至7.0)；流动相b：甲醇洗脱程序：表1时间(min)a％b％0-20901020-4090→3210→6840-55326855-5632→9068→1056-659010流速：1.0ml/min；检测波长：234nm；柱温：30℃；进样体积：10μl。图6缓冲溶液ph为7.0，有机相为甲醇，流动相流速为1.0ml/min时梯度洗脱的hplc图，图6中1号峰为2-噻吩乙胺，2号峰为4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐，3号峰为杂质a，4号峰为杂质b，5号峰为杂质c，6号峰为杂质d。可以看出在该条件下4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰可以与原料和杂质达到良好分离，且4,5,6,7-四氢噻吩[3，2-c]吡啶盐酸盐主峰在21.5min左右。但各色谱峰拖尾严重，而且基线不平稳，不利于色谱峰的积分。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12