一种用于检测创面或LB培养液细菌感染的近红外光谱系统及其检测方法与流程

本发明涉及生物医疗领域及医疗设备技术，具体涉及一种用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统及其检测方法。

背景技术：

感染性疾病是引起临床高致病率和高致死率的主要原因，包括呼吸道感染、消化道感染、腹腔感染、血液感染、皮肤软组织感染等。目前临床常用的细菌检测方法是革兰氏染色、菌落观察、免疫组化等，但这些方法存在特异性及灵敏度低、操作复杂、分析时间过长。利用分子生物学、免疫学和遗传学方法鉴别细菌的技术因样品纯化处理时间较长，操作复杂，需要专业人员，而且仪器和试剂费用较高，难以在常规实验室中实现广泛应用，如表1列举了不同检测方法对比。

表1致病菌不同检测方法对比表

随着目前各种新发感染性疾病的出现及病原菌耐药性的持续上升，微生物实验室检测在感染性疾病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。同时也面临着更高的要求，如更短的标本周转时间、更及时准确的报告结果等。

在过去的几十年里，非侵入式光散射设备因成本廉价、精准度高已经成为非常热门的快速鉴定致病菌的一种技术。根据波长的长短，光可分为可见光、红外线、紫外线、x射线，其中可见光易受到周围环境的影响，对检测环境和仪器要求较高。紫外线和x射线会损坏生物样本。中红外波段水信号较强，对生物样本检测的背景影响较大。近红外波段水成分吸收效应明显减弱，光的穿透能力在近红外波段比在其他波段更强，对生物样本检测的背景影响较小，尤其在1100-2500nm范围。由于避开了生物组织内水的吸收影响，因此更适合用于生物样本检测。

细菌分为两大类：革兰氏阳性菌(g+)和革兰氏阴性菌(g-)。两者主要的区别是细胞壁构造和化学组成不同。g+细菌的细胞壁较厚(20～80nm)，但化学组成比较单一，只含有90％的肽聚糖和10％的磷壁酸；g-细菌的细胞壁较薄(10～15nm)，却有多层构造(肽聚糖和脂多糖层等)，其化学成分中除含有肽聚糖以外，还含有一定量的类脂质和蛋白质等成分。两者组内各种细菌化学组成相似，肽聚糖支架均相同,只是四肽侧链的组成及其连接方式随菌种而异。近红外光与物质相互作用时能产生吸收、反射、散射等现象，而这些现象与生物分子的各种功能键、结构和浓度(含量)相关，并可通过光谱强度或光谱频率的变化得以呈现。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提出一种用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统及其检测方法。利用近红外光谱仪采集细菌漫反射光谱数据，输入数据库模块，进行数据分析，得到最终检测结果并通过显示器显示。为临床快速检测致病菌提供可靠的工具，实现细菌的快速精确识别，提高临床病人的治愈率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统的检测方法，包括以下步骤：

采集样本步骤，将已知细菌种类和数量的lb培养液加入检测池，放置于样品检测支架，采集样本的近红外漫反射光谱；或，将已知细菌种类和数量的创面放置于检测平台，采集样本的近红外漫反射光谱；

建数据库步骤，对近红外漫反射光谱进行预处理后，采用基于主成分分析的支持向量机，建立定性定量关联模型，组建数据库模块；

分析诊断步骤，通过光谱输入模块控制近红外光谱仪采集未知种类细菌的创面或lb培养液的近红外漫反射光谱，输入数据库模块，进行数据分析，通过功能模块输出结果，得出诊断结论。

进一步地，建数据库步骤中对900–2200nm波段近红外漫反射光谱进行归一化和平滑处理，归纳统一样本的统计分布性和消除噪音。

进一步地，建数据库步骤中定性定量关联模型为采用基于主成分分析的支持向量机法将光谱数据与微生物数据一一对应建立而成。

进一步地，所述lb培养液(luria-bertani培养液)为采用本领域常规方案制备得到。

进一步地，分析诊断步骤中将采集软件、定性定量模型和结果输出模型整合在一起，形成一套完整的系统。分析诊断步骤就是利用整合的系统完成数据采集、处理及结果输出。

一种用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统，包括近红外光谱仪和计算机控制系统；所述近红外光谱仪包括宽谱液晶可调谐滤波器、光源、光纤反射探头、样品检测支架、检测池；

所述计算机控制系统包括光谱数据输入模块、数据库模块、功能模块、附件模块；

1)光谱输入模块主要通过控制硬件，采集和输入光谱数据；

2)数据库模块负责存储光谱样本、关联模型、模型参数集，可支持动态查询、导入/导出功能；可在系统空闲时，利用数据库模块存储的光谱样本、模型参数集，输入到关联模型，指导其优化，实现该系统的自学习功能；

3)功能模块为根据数据库里的模型，实现诊断功能，可视化显示结果；

4)附件模块为一般诊断系统的共性模块，包括文件管理、结果打印模块。

进一步地，所述样品检测支架为黑色材质，反射率≈0％。

进一步地，样品检测支架设有光纤反射探头固定孔、实验台和底座；所述光纤反射探头固定孔通过高度调节装置实现高度调节。

进一步地，根据光纤反射探头距离检测品的光程要求上下调节旋转钮，调节最小刻度为0.5cm，可垂直移动20cm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的近红外光谱系统首先采用高精度近红外光谱仪，对创面或lb培养液进行检测，具有非接触性、快速、准确、低廉、无试剂反应等优点。为精确的创面或lb培养液内细菌种类和含量检测提供重要的检测依据和基础。对临床感染的快速诊断、尽早使用针对性抗生素、降低耐药菌株的出现频率具有重要意义，可满足医院医疗等多种应用场所的需求。

该近红外光谱系统采用自制控制系统，用户界面操作简单，能够精确快速地进行未知细菌的种类识别。

附图说明

图1为本发明近红外光谱系统的结构示意图；

图2为本发明样品检测支架的结构示意图；

图3为本发明计算机控制系统的控制逻辑图；

图4为利用本发明检测lb培养液中临床常见七种细菌的原始光谱图；

图5为利用本发明检测lb培养液中不同浓度金黄色葡萄球菌的原始光谱图；

图6为利用本发明检测lb培养液中耐甲氧西林金葡菌(mrsa)和甲氧西林敏感金葡菌(mssa)原始光谱图；

图7为轻度金黄色葡萄球菌感染创面(a)和重度金黄色葡萄球菌感染创面照片(b)；

图8为轻度大肠杆菌感染创面照片；

图9为轻度金黄色葡萄球菌感染创面和重度金黄色葡萄球菌感染创面原始光谱图；

图10为轻度金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染创面原始光谱图。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明进行具体的描述，但不限于此。实施例及应用例所用的原材料均为市购。

实施例1

如图1～2所示，一种用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统，包括近红外光谱仪和计算机控制系统；近红外光谱仪包括宽谱液晶可调谐滤波器、光源、光纤反射探头、样品检测支架3、检测池5；

计算机控制系统包括光谱数据输入模块、数据库模块、功能模块、附件模块；

1)光谱输入模块主要通过控制硬件，采集和输入光谱数据；

2)数据库模块负责存储光谱样本、关联模型、模型参数集，可支持动态查询、导入/导出功能；可在系统空闲时，利用数据库模块存储的光谱样本、模型参数集，输入到关联模型，指导其优化，实现该系统的自学习功能；

3)功能模块为根据数据库里的模型，实现诊断功能，可视化显示结果；

4)附件模块为一般诊断系统的共性模块，包括文件管理、结果打印模块。

样品检测支架3为黑色材质，反射率≈0％。

样品检测支架3设有光纤反射探头固定孔31、实验台32和底座33；光纤反射探头固定孔通过高度调节装置实现高度调节。

根据光纤反射探头距离检测品的光程要求上下调节旋转钮，调节最小刻度为0.5cm，可垂直移动20cm。

检测池5为直径2cm圆形均质玻璃结构，用于盛装待检测液体样品。

该用于检测创面或lb培养液细菌感染的近红外光谱系统的检测方法，包括以下步骤：

1、采集样本步骤：

(1)将浓度为10⁹cfuml^-1的临床常见七种细菌lb培养液加入检测池，放置于样品检测支架，采集样本的近红外漫反射光谱；

临床常见七种细菌分别为：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。

(2)将浓度分别为10¹cfuml^-1、10²cfuml^-1、10³cfuml^-1、10⁴cfuml^-1、10⁵cfuml^-1、10⁶cfuml^-1、10⁷cfuml^-1、10⁸cfuml^-1、10⁹cfuml^-1的金黄色葡萄球菌lb培养液加入检测池，放置于样品检测支架，采集样本的近红外漫反射光谱；

(3)将浓度为10⁹cfuml^-1的mrsa和mssa的lb培养液加入检测池，放置于样品检测支架，采集样本的近红外漫反射光谱；

(4)将金黄色葡萄球菌不同感染程度的创面(浓度分别为(4.7±0.3)×10³cfuml^-1、(7.3±1.4)×10⁶cfuml^-1)，放置于检测平台，采集样本的近红外漫反射光谱；

(5)将金黄色葡萄球菌感染创面和大肠杆菌感染创面(浓度分别为(4.7±0.3)×10³cfuml^-1、(4.2±0.4)×10³cfuml^-1)，放置于检测平台，采集样本的近红外漫反射光谱；

近红外漫反射光谱的波长为900-2200nm范围，得到原始光谱图，如图4-6、9-10所示。

2、建数据库步骤：

对近红外漫反射光谱进行预处理后，采用基于主成分分析的支持向量机，建立定性定量关联模型，组建数据库模块；

建数据库步骤中对900–2200nm波段近红外漫反射光谱进行归一化和平滑处理，归纳统一样本的统计分布性和消除噪音。

建数据库步骤中定性定量关联模型为采用基于主成分分析的支持向量机法将光谱数据与微生物数据一一对应建立而成。

1.主成分分析方法(pca)

主成分分析方法(pca)是一种无监督降维算法，主要思想是将n维特征映射到k维上，这k维是全新的正交特征也被称为主成分，是在原有n维特征的基础上重新构造出来的k维特征，使投影后样本点的方差最大化。pca优化的目标函数为：

其中tr是矩阵的迹，w是特征向量。

上式通过拉格朗日乘子法可得：

xx^twi＝λiwi(2)

于是，只需对协方差矩阵xx^t进行特征值分解，将求得的特征值降序排序，再取前k个特征值对应的特征向量构投影矩阵w^*＝(w1,w2,...,wk)，这就是主成分的解。

2.支持向量机svm

设给定的数据集为(xi,yi)，i＝1,2,ll，其中l为训练样本数，xi为样本点特征向量，yi为样本点所属类别，(xi,yi)为样本点。决策边界的可如下公式表示：

f(x)＝(w·x)+b＝0

w＝(w1,w2,lwn)为权重向量，n为特征数，b为偏移量是标量。假设二分类的数据问题，

寻找到的决策边界与支持向量的关系为：决策边界到两类支持向量的距离相等。则最大边缘为2/||w||，其中||w||＝|w·x+b|。计算决策边界需计算其参数w和b：

最小化：

约束条件：

yi[(w·xi)+b]-1≥0,i＝1,2ll

引入拉格朗日函数解决以上约束优化问题：

其中，α＝(α1,α2,...,αl)^t为拉格朗日乘子向量。根据拉格朗日对偶性，将式(2.20)对w和b求偏导，并令偏导为零，即将以上问题转化成对偶问题：

最大化：

约束条件：

通过以上计算可得到α的最优解最优权值和最优偏移的解为：

式中下标仅当αi不为零时进行计算，大部分情况αi＝0，若αi≠0则使式(2.20)成立的样本向量为支持向量。最优分割超平面为(w*·x)+b*＝0，最优决策函数为：

其中，x∈rⁿ为待分类的数据，sgn为符号函数。在计算最优决策函数时，只对支持向量进行求和，分类结果仅由αi≠0的支持向量样本决定。

对于线性不可分的情况，令φ(·)代表该非线性映射，k(xi,x)＝(φ(xi)·φ(x))为核函数，则非线性可分的最优决策函数为：

常见的核函数有：

线性函数：k(xi,x)＝(xi·x)

多项式函数：k(xi,x)＝[(xi·x)+1]^d

高斯径向函数：

3、分析诊断步骤：

通过光谱输入模块控制近红外光谱仪采集创面和lb培养液的近红外漫反射光谱，输入数据库模块，进行数据分析，通过功能模块输出结果，得出诊断结论。

七种细菌原始光谱图如图4所示，定性模型预测准确率见表1

表1七种细菌svm建立模型预测准确率

不同浓度金黄色葡萄球菌原始光谱图如图5所示，定量模型预测准确率见表2

表2不同浓度金黄色葡萄球菌svm建立模型预测准确率

mrsa和mssa原始光谱图如图6所示，定性模型预测准确率见表3

表3svm建立mrrs和mssa模型预测准确率

在体轻度金黄色葡萄球菌感染创面和重度金黄色葡萄球菌感染创面(图7)的原始光谱图如图9所示，定量模型预测准确率见表4

表4轻度和重度金黄色葡萄球菌感染创面svm建立模型预测准确率

在体轻度大肠杆菌感染创面(图8)和在体轻度金黄色葡萄球菌感染创面的原始光谱图如图10所示，定量模型预测准确率见表5

表5svm建立的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染创面模型预测准确率

本系统利用近红外光谱仪采集待检测品光谱曲线，通过计算机系统处理分析，得到最终检测结果并通过显示器显示。实现快速、准确、低廉、无试剂反应的细菌种类和数量识别，对临床感染的快速诊断、尽早使用针对性抗生素、降低耐药菌株的出现频率具有重要意义。本系统自动化程度高，计算机系统用户界面操作简单，可满足医院医疗等多种应用场所的需求，包含了广大的用户群，具有广泛应用的潜力。