一种儿茶酚胺的LC-MS/MS检测方法及预处理试剂盒与流程

本发明属于儿茶酚胺检测预处理技术领域，具体涉及一种儿茶酚胺的lc-ms/ms检测方法及预处理试剂盒。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

儿茶酚胺(catecholamines,cas)是一类含有二羟基苯基的胺类化合物，是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。其主要包括肾上腺素(epinephrine,e)、去甲肾上腺素(norepinephrine,ne)、多巴胺(dopamine,da)。

儿茶酚胺类物质作为神经递质和激素物质，具有较强的生理学活性，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆和尿液中cas及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。儿茶酚胺类物质，作为维持人体正常运转的重要神经递质，与神经内分泌疾病有重要的相关性。目前，临床上关于儿茶酚胺类及其代谢物质在人体内含量的检测，主要是用于嗜铬细胞瘤或副神经节瘤的诊断筛查；神经母细胞瘤及相关肿瘤诊断及复查；评价自主神经功能障碍、自主神经功能衰竭、自主神经功能病变。临床研究发现检测生物样本中的cas水平不仅对于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义，并且有助于甲状腺功能异常、充血性心力衰竭、糖尿病、肾脏功能不全等疾病的诊断。同时，对于神经电生理等基础医学研究也具有重要的意义。

目前，国内外检测血液中儿茶酚胺类物质的方法有荧光法、放射免疫法、生物法及高效液相色谱法等。其中荧光法的检测限较高，使得测定时的灵敏度达不到要求；放射免疫法的操作步骤繁琐，价格也比较昂贵，难以在临床上推广普及。

高效液相色谱-串联质谱法不仅具有高效、高通量、高灵敏度、高特异性等优点，而且针对离子对进行检测，特异性高，能够避免交叉反应的干扰，检测结果更加准确可靠，成为研究儿茶酚胺类物质的首选方法。但是，人体内儿茶酚胺类不仅含量相对较低，且极易被氧化，在血液中的半衰期短。抽取后的血液样本在在-20℃及以下稳定保存三天，将血液样本中的儿茶酚胺提取后，在4℃避光条件下半衰期仅为12h。当采用高效液相色谱串联质谱进行高通量检测时，检测样本量大，假设每个样本检测需要10min，60个样本的检测需要至少10个小时，这样就造成提取后的样本检测排序的先后顺序造成检测样本的准确性差。而且儿茶酚胺类物质在人体中的含量很低，提取过程中的损失及样本提取后的稳定性问题成为应用lc-ms/ms检测人体血液样本中儿茶酚胺含量的难题。

技术实现要素：

针对上述研究背景，本发明提供了一种儿茶酚胺的lc-ms/ms检测方法，通过优化提取方法，保证了血液中儿茶酚胺的良好回收率，降低基质效应；另外通过加入稳定剂的方式有效的维持血液样品中儿茶酚胺的稳定，以满足高通量检测的要求，保证了检测的准确性。

基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种血液样品中儿茶酚胺的预处理方法，所述预处理方法包括以下步骤：

向待处理血液样品中加入稳定剂、内标液及甲酸水混均后离心，取上清部分经弱阳离子交换后再加入淋洗液进行淋洗，吹干后加入洗脱液进行检测。

优选的，所述稳定剂为edta、草酸及巯基乙醇的混合溶液。

进一步优选的，所述稳定剂中，edta、草酸及巯基乙醇的摩尔比为1.8～2.2:0.8～1.2:0.8～1.2。

本发明通过优化稳定剂的组成和配比，得到的上述稳定剂配方，在不影响儿茶酚胺的lc-ms/ms检测的同时，能够增加了儿茶酚胺类物质的稳定性，使样品提取过程最大程度的减少损失，样品提取后能够在24h内保持稳定。

进一步优选的，所述内标液为氘代甲基氢多巴胺标准品、氘代甲基氢肾上腺和氘代去甲肾上腺素标准品的混合液。

进一步优选的，所述甲酸水浓度为0.08～0.12％。

进一步优选的，所述离心采用11000～13000rpm离心1.5～2.5min。

进一步优选的，所述淋洗液依次为乙酸铵、异丙醇及二氯甲烷。

在一些具体的实施例中，所述淋洗的具体步骤如下：

依次加入8～12mm乙酸铵，正压25～35s；再加入异丙醇，正压25～35s后吹干；再加入二氯甲烷静置1.5～2.5min，正压25～35s后吹干。

进一步优选的，所述洗脱液为含0.2％甲酸的水与甲醇的混合溶液。

在一些具体的实施例中，所述0.2％甲酸的水：甲醇体积比为85～95：5～15。

儿茶酚胺在人体血液中含量极低，正常人含量在pg/ml级别，血液样品中的基质会对儿茶酚胺的质谱检测造成很大的干扰，通过优化提取方法，既能有效降低基质效应，而且可以最大程度保证儿茶酚胺从血液中提取。通过加入稳定剂，既可以减少提取过程中造成的儿茶酚胺氧化分解，而且提取后的儿茶酚胺在4℃环境避光稳定24h，因此在进行高通量样本检测时，可以保证样本中儿茶酚胺的含量不会因为进样时间的差异造成损失，从而保证了儿茶酚胺定量的准确性。

另外，本发明提供的提取方法最后一步洗脱后，无需氮吹复溶，大大缩短了提取时间，单一样本提取只需15-20min，配合弱阳离子交换96孔板，可以实现样品的批量处理。

本发明第二方面，提供一种儿茶酚胺预处理试剂盒，所述试剂盒中包括稳定剂、内标液、弱阳离子交换板、淋洗液及洗脱液。

优选的，所述试剂盒的使用方法依照第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法的步骤进行。

本发明第三方面，提供一种儿茶酚胺的lc-ms/ms检测方法，所述检测方法包括以下步骤：通过第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法获取待测血液样品，通过液相-二级质谱对待测血液样品进行检测。

优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：通过第一方面所述血液样品中儿茶酚胺的预处理方法获取待测血液样品，配置标准工作液及质控品，通过检测标准品获取浓度与峰面积的对应关系制作标准曲线，经液相-二级质谱对待测血液样品进行检测获得相应的儿茶酚胺浓度。

进一步优选的，所述标准工作液及质控品采用牛血清白蛋白(bsa)作为空白基质

进一步优选的，所述高效液相的流动相如下，流动相a：含有0.2％甲酸0.05mm甲酸铵的水溶液；流动相b：含有0.2％甲酸的甲醇：乙腈(8：2，v/v)溶液。

进一步优选的，所述液相色谱柱采用五氟苯基(pfp)色谱柱。

进一步优选的，所述液相采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱程序如下：0.0～1.0min，1％b；1.0min～1.5min，至60％b；1.5～3.0min，60％b；3.0min～3.1min，至98％b；3.1～5.0min，98％b；5.0～5.1min，至1％b；7.1～7.0min，1％b。

进一步优选的，所述质谱采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式。

进一步优选的，所述质谱离子源温度为250-350℃。

进一步优选的，所述喷雾电压为2900～3100v。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法针对三种不同的儿茶酚胺，前处理过程较简单，便于操作，安全且样本用量少，整个实验成本低。

本发明方法针对每一种儿茶酚胺一对定性和一堆定量的离子，以各种儿茶酚胺的保留时间和定性离子作为定性依据，从而保证实验结果的准确性以及有效性。

本发明方法针对儿茶酚胺在测定过程中的不稳定性，在提取时加入稳定试剂，来增加其在整个提取过程及lc-ms/ms检测过程中儿茶酚胺的稳定性，从而保证了测定结果的可靠性以及可重复性。

本发明针对儿茶酚胺的检测样本前处理及检测过程耗时短，且样本儿茶酚胺含量稳定，可以满足lc-ms/ms高通量的要求。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例中标准物质中多巴胺的色谱峰。

图2为实施例中标准物质中肾上腺素的色谱峰。

图3为实施例中标准物质中去甲肾上腺素的色谱峰。

图4为实施例中血浆中多巴胺(da)、肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)的色谱峰，保留时间依次为3.02min、2.17min、1.41min。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种儿茶酚胺的lc-ms/ms检测方法及预处理试剂盒。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例中，提供一种儿茶酚胺的lc-ms/ms检测方法。

1)标准品制备

精密称取多巴胺标准品2mg，放置于10ml的容量瓶中，用甲酸溶液定容，获得200ng/ml的多巴胺标准品储备液。肾上腺素和去甲肾上腺素标准品储备液制备方法同上。分别取一定量的多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素标准品储备液，通过加入(2％～5％)bsa溶液进行稀释从而配置成浓度为5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml的多巴胺标准品，6.25pg/ml、12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml的肾上腺素标准品，62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml的去甲肾上腺素标准品。

2)质控品制备

分别一定量的多巴胺标准品储备液，加入(2％～5％)bsa溶液，多巴胺质控品低、高浓度分别为30pg/ml、150pg/ml，肾上腺素质控品低、高浓度分别为30pg/ml、300pg/ml，肾上腺素以及去甲肾上腺素质控品低、高浓度分别为200pg/ml、3000pg/ml。

3)内标液制备

分别称取氘代甲基氢多巴胺标准品及氘代甲基氢肾上腺和去甲肾上腺素标准品2mg，分别放置于10ml的容量瓶中，用甲醇定容，然后稀释，得到内标液，其中多巴胺内标浓度为10μg/ml；肾上腺素内标浓度为20μg/ml；去甲肾上腺素内标浓度为200μg/ml。

4)样本制备

取400μl样品，加入50μl的稳定剂，10μl内标液，200μl0.1％甲酸水溶液，混匀，12000rpm离心2min；接着将样品转移入经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板中，静置2min后，正压30s；依次加入淋洗液10mm乙酸铵500μl，正压30s，异丙醇500μl，正压30s后，30℃下吹干板，二氯甲烷500μl，静置2min，正压30s后，30℃下吹干板。洗脱加入100μl洗脱液，洗脱液为含0.2％甲酸的水：甲醇(90：10，v/v)，接96孔进样板，覆上铝膜，上机检测。标准品、质控品的的提取方法同上。

5)样品检测

色谱柱：五氟苯基(pfp)色谱柱；柱温：40℃；流动相a：含有0.2％甲酸0.05mm甲酸铵的水溶液，流动相b：含有0.2％甲酸的甲醇：乙腈(8：2，v/v)溶液；梯度洗脱条件(如表1)；流速：0.3ml/min，进样量：20μl，自动进样器温度：4-5℃，避光。

表1梯度洗脱条件

质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测，

离子源温度：250-350℃

喷雾电压：3000v

质谱参数如表2所示：

表2mrm质谱参数

6)检测结果

标准曲线建立：以da、e、ne标准品浓度为横坐标，以da、e、ne与其内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线。检测血浆样品，将血浆样品中待测物与其内标峰面积比，代入建立的da、e、ne标准曲线中，计算得到da、e、ne人血浆样品中da、e、ne浓度。

7)加入稳定液提取血浆加标的da、e、ne的提取后检测，加标量

da：50pg/ml、e：500pg/ml、ne：1000pg/ml，提取后置于4℃，避光12h、24h、48h的含量结果，见表3。加入稳定液后，可以在4℃稳定24h。

表3da、e、ne的含量检测结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。