定量IL-33的方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月11日提交的美国临时专利申请no.62/655,887的权益和优先权，并将其以引用的方式全文并入。

本发明的各方面整体涉及用于检测和定量细胞因子包括但不限于白介素33(il-33)的免疫测定法。

背景技术：

白介素33(il-33)是一种响应损伤信号或侵害(诸如香烟烟雾)而上调的细胞因子。其在坏死时由屏障组织释放，并传播针对受损组织存在的免疫应答。这种“警报素(alarmin)”信号可放大先天免疫和适应性免疫的炎性应答。已公布的数据表明，用于检测可溶性il-33的商用试剂盒生成不可靠的结果，这可能是由于内源性结合伴侣(诸如可溶性st2受体)的干扰造成的(nygaard,u.等人，springerplus,5:33(2016)；ketelaar,m.e.,clinexpallergy,46(6):884-7(2016)；rivière,e.等人，annrheumdis,75(3):633-5(2016))。

配体结合测定法在复杂基质(诸如血清)中的性能可能会受到干扰该测定法的特定内源性组分的影响(zhong,z.d.等人，aapsj,19:1564(2017))。免疫测定法中的干扰可能会导致实验室错误解读患者的结果以及医师给予错误的治疗过程(tate,j.等人，clinbiochemrev.2004,25(2):105–120)。

其他人已尝试开发更好的免疫测定法。doucet,j.等人报道了改进的il-13测定法，其包括酸解离步骤(doucet,j.等人，diseasemarkers,35(5):465-474(2013))。doucet描述的免疫测定法是il-13特异性的，不检测il-33。此外，doucet的免疫测定法不需要在检测之前中和样品，并且在该测定法过程中不使用阻断剂来防止细胞因子复合物的重新形成。

因此，需要用于检测il-33的新的测定法和方法。

技术实现要素：

提供了用于检测和定量细胞因子的方法和组合物。相对于可商购获得的测定法和/或对照测定法，所公开的测定法具有减少的测定法干扰。所述干扰可能是细胞因子依赖性的、非细胞因子依赖性的或这两者。一个实施方案提供了一种il-33免疫测定法，其可减少由样品中存在的内源可溶性il-33结合分子引起的测定法干扰。示例性的可溶性il-33结合分子包括但不限于抗il-33抗体、可溶性st2受体和血清组分。在一些实施方案中，将阻断剂添加至样品以减少、抑制或阻断样品中的il-33复合物在酸解离样品中的il-33复合物后重新形成。在一个实施方案中，阻断剂和检测试剂不竞争结合il-33。

另一个实施方案提供了使用电化学发光免疫测定法来确定人血清样品中的总il-33浓度的方法。该测定法包括对血清样品进行酸预处理以解离样品中存在的可溶性配体:药物复合物并改善在存在药物的情况下对il-33的检测，从而提供总il-33水平的定量测量。在这个实施方案中，该程序采用链霉亲和素包被的板(具有作为捕集试剂的生物素化抗人il-33抗体，并且利用重组il-33作为标准品。将标准品、对照和样品稀释于乙酸中，并用含有检测试剂(例如钌标记的抗人il-33抗体)的tris-碱溶液中和。还将与抗il-33抗体结合的抗体和抗st2受体抗体添加至该tris溶液，以最大程度地减少药物(即抗体与il-33结合的抗体)或内源可溶性st2受体的干扰。然后将中和的标准品、对照和样品添加至所述板。通过读板仪根据在向板上施加电压时由钌标签生成的化学发光信号来测量在板上捕集的il-33。所得的电化学发光信号(即计数)与血清样品中存在的il-33的量成比例。

在一个实施方案中，该方法具有12.5pg/ml的灵敏度和>50ng/ml的st2耐受性。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方案的示例性测定法方案的示意图。--钌标签，■-生物素，-链霉亲和素

图2a是回收率对rhst2浓度(ng/ml)的线图。(■)c-ad酸处理；(●)c-ad无酸；(□)c-a-d酸处理；(○)c-a-d无酸。图2b是示出了来自三个个体(个体1、个体2和个体3)的血清中的内源性il-33检测的柱状图，其在指定条件下测定：c-a-d无酸、c-ad无酸、c-a-d酸以及c-ad酸。

图3是柱状图，示出了使用改良的测定法，添加rst2以及添加抗il-33单克隆抗体，来自个体1和个体3的血清中的内源性il-33特异性。

图4是多次测量后个体1和个体3的il-33浓度(pg/ml)的图，显示该测定法是精确的。

图5是示出了用于检测il-33的方法在存在抗il-33mab的情况下的耐受性的线图，其在指定条件下测定：c-ad酸处理以及c-a-d酸处理。

图6是来自正常个体和患有哮喘、copd和特应性皮炎的个体的血清中的内源性il-33(pg/ml)的图。从商业供应商处购买了各自来自4个不同群体的25名个体，并使用测定法即具有酸处理的c-ad测定法筛选内源性il-33。

图7a和图7b是示出了来自经处理的小鼠和对照小鼠的人il-33(pg/ml)的图。

具体实施方式

i.定义

应当理解，本公开不限于本文描述的组合物和方法以及描述的实验条件，因为它们可能会有所不同。还应当理解本文所用的术语仅用于描述某些实施方案的目的，并且并非旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由随附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一致。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何组合物、方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。所提及的所有出版物均以引用的方式全文并入本文。

如本文所用，术语“结合分子(bindingmolecule)”旨在指与特定靶标特异性相互作用并与之结合的分子。靶标可包含生物分子或小(化学)分子。靶标分子可以定义抗原或抗原部分。结合分子的实例包括但不限于抗体(包括单克隆抗体、双特异性抗体以及抗体片段)、融合蛋白和本领域技术人员已知的其他抗原结合分子。

如本文所用，术语“抗体(antibody)”是结合分子的实例，并且是指免疫球蛋白，其通常包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(h)和两条轻链(l))。每条重链包含重链可变区(hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链含有一个轻链可变区(lcvr或vl)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(cl1)。vh区和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分(antigen-bindingportion)”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体的保留特异性结合抗原(如hil-33)的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分(antigen-bindingportion)”中所涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，即包含vl、vh、cl1和ch1结构域的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两个f(ab)’片段的二价片段；(iii)包含vh和ch1结构域的fc片段；(iv)包含抗体单臂的vl和vh结构域的fv片段，(v)dab片段(ward,e.s.等人，nature241:544-546(1989))，其包含vh结构域；以及(vi)cdr。此外，尽管fv片段的两个结构域(vl和vh)由独立的基因编码，但它们可以利用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够作为单条连续链制备，其中vl区和vh区配对而形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如bird,r.e.等人，science242:423-426(1988)；和huston,j.s.等人，proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988))。这类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分(antigen-bindingportion)”内。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双抗体(参见例如，holliger,p.等人，proc.natl.acadsci.usa90:6444-6448(1993))。

“cdr”或互补决定区是散布在更保守的称为“框架区”(fr)的区域内的高变区。fr可以与人种系序列相同，或者可以是经天然修饰的或经人工修饰的。

术语“表位(epitope)”是与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有不止一个表位。表位可以是构象表位或线性表位。构象表位是由在空间上并置的来自线性多肽链不同片段的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。

术语“测定法干扰(assayinterference)”是指测定法中阻断或抑制分析物(诸如il-33或抗il-33抗体)的检测的内源性组分。改变分析物的可测量浓度或改变抗体结合的物质可潜在地导致免疫测定法干扰。测定法干扰可以是分析物依赖性的或非分析物依赖性的。非分析物依赖性干扰是指溶血、脂血以及抗凝血剂和样品存储的效应的普通干扰，并且与分析物浓度无关。免疫测定法中的分析物依赖性干扰是指样品中的成分与一种或多种试剂抗体之间的相互作用。它们包括具有化学差异但具有结构相似性的化合物，其可与抗体交叉反应。天然的干扰性内源物质、多反应性的抗体或自身抗体(嗜异性抗体)、人抗动物抗体、或抗药物抗体(ada)以及个体特有的其他未意识到的结合蛋白，可能会干扰分析物与免疫测定法中的试剂抗体之间的反应。干扰可能是由分析物的可溶性结合靶标、分析物的内源性配体(包括但不限于分析物的可溶性受体、分析物的可溶性配体、分析物的脱落受体)、或血清因子诸如类风湿因子和生物素引起的。干扰可能是由于分析物的抗体引起的。

术语“st2”是指il-33的受体，其也被称为白介素-1受体样1(il-1rl1)。st2可以是膜结合的或可溶的。

术语“免疫测定法(immunoassay)”是指一种检测测定法，其并入了直接或间接地免疫特异性结合分析物的结合部分。通常，结合部分是抗体。抗体可以用可检测标签标记。

术语“il-33复合物(il-33complex)”是指il-33与血液、血浆或血清的组分的非共价缔合。通常，il-33复合物含有与蛋白质例如蛋白质药物产品、抗药物抗体、il-33的配体或它们的组合非共价结合的il-33。

ii.il-33检测和定量测定法及其使用方法

提供了用于检测和定量il-33的测定法和方法。所公开的测定法和方法可用于检测和定量样品中的il-33。在一个实施方案中，样品获自用il-33拮抗剂或用il-33治疗过的或正用其治疗的受试者。

相对于可商购获得的测定法和/或对照测定法，所公开的测定法具有减少的测定法干扰。所述干扰可能是il-33依赖性的、非il-33依赖性的或这两者。在一个实施方案中，该方法可减少或抑制由样品中存在的内源可溶性il-33结合分子引起的测定法干扰。示例性的可溶性il-33结合分子包括但不限于抗il-33抗体、可溶性st2和血清组分。在一些实施方案中，将阻断剂添加至样品以减少、抑制或阻断样品中的il-33复合物在使样品中的il-33复合物酸变性后重新形成。在一个实施方案中，阻断剂和检测试剂不竞争结合il-33。

在一个实施方案中，该方法具有12.5pg/ml的灵敏度和>50ng/ml的st2耐受性。

a.白介素33

在一个实施方案中，il-33或“人白介素-33”或“人il-33”是指270个氨基酸的全长、未经处理的il-33(参见，例如uniprotkb登录号o95760和公开号为20180155436的美国专利申请，二者均以引用的方式全文并入)，或其生物活性片段，以及在细胞内加工而产生的il-33的任何形式。该术语还涵盖il-33的天然存在的变体，例如剪接变体(参见例如，hong等人，(2011),j.biol.chem.286(22):20078-20086)、或等位基因变体或il-33的任何其他同源异构体(isoform)，诸如wo2016/156440中所述的il-33的氧化形式或还原形式。可以通过抗体或其抗原结合片段或通过il-33陷阱蛋白(trap)中和、抑制、阻断、消除、减弱、减少或干扰的il-33活性包括但不限于il-33受体介导的信号转导的抑制或il-33介导的炎症的抑制。

b.检测il-33的方法

一个实施方案提供了一种通过将样品酸化至足以使样品中的il-33复合物解离的ph并用缓冲碱溶液中和经酸化的样品来检测样品中的il-33的方法。还将捕集试剂和检测试剂添加至样品中以检测il-33。在某些实施方案中，将阻断剂添加至样品中以抑制、减少或阻断样品中的组分结合il-33。

另一个实施方案提供了一种通过将样品酸化至足以从样品中的il-33复合物解离出il-33的ph，然后用含有检测试剂的缓冲碱性溶液中和经酸化的样品来降低测定法干扰的方法。任选地，可以在单独的步骤中将抑制il-33复合物在样品中重新形成的阻断剂添加至样品中，或者该阻断剂可存在于缓冲碱性溶液中。该方法包括将捕集试剂添加至样品中并检测所述检测试剂，其中所检测到的检测试剂的量与样品中的il-33的量相关。捕集剂可以作为单独的步骤添加，或者可以存在于酸化步骤中或缓冲碱性溶液中。通常，样品中存在的il-33复合物含有与可溶性st2非共价缔合的il-33。

另一个实施方案提供了一种通过将血清样品酸化至足以使样品中的il-33复合物解离的ph，随后用缓冲碱性溶液中和经酸化的样品来定量血清样品中的白介素-33的方法，该缓冲碱性溶液含有(a)用可检测标签标记的抗人il-33抗体，以及任选的(b)抗人st2抗体。该方法包括将样品添加至含有生物素化抗人il-33抗体的链霉亲和素包被的固体支持物上，并检测该亲和素包被的固体支持物上的所述可检测标签，其中所检测到的可检测标签的量与样品中的il-33的量相关。

另一个实施方案提供了一种使用电化学发光免疫测定法来确定人血清样品中的总il-33浓度的方法。该测定法包括对血清样品进行酸预处理以解离样品中存在的可溶性配体:药物复合物并改善在存在药物的情况下对il-33的检测，从而提供总il-33水平的定量测量。配体:药物复合物包括但不限于与抗il-33抗体非共价结合的il-33。示例性的抗il-33抗体公开于美国专利no.10,000,564和no.9,453,072，将这些专利以引用的方式全文并入。在这个实施方案中，该程序采用链霉亲和素包被的板(具有作为捕集试剂的生物素化抗人il-33抗体，并且利用重组il-33作为标准品。将标准品、对照和样品稀释于乙酸中，并用含有检测试剂(例如钌标记的抗人il-33抗体)的tris-碱溶液中和。还将与抗il-33抗体结合的抗体和抗st2受体抗体添加至所述tris溶液，以最大程度地减少药物或内源可溶性st2受体的干扰。然后将中和的标准品、对照和样品添加至所述板。通过读板仪根据在向板上施加电压时由钌标签生成的化学发光信号来测量在板上捕集的il-33。所得的电化学发光信号(即计数)与血清样品中存在的il-33的量成比例。

在一个实施方案中，将样品中检测到的标签的量与参考标准进行比较，所述参考标准用已知浓度的il-33和对于所述浓度的相应量的检测到的标签校准。样品中的il-33的量可通过将样品中检测到的标签的量与参考标准进行比较，并将检测到的标签的量与对于所述检测到的标签的量参考标准上显示的浓度相匹配来确定。

1.生物样品

在所公开的方法中使用的样品通常是生物样品，诸如含有待检测的分析物(例如il-33或其复合物)的生物流体。生物流体包括但不限于血液、血浆、血清和唾液。在一个优选的实施方案中，生物样品是人生物样品。

在某些实施方案中，样品获自患有或怀疑患有炎性病症、疾病或障碍的受试者。代表性的炎性病症、疾病和障碍包括但不限于克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、特应性皮炎、哮喘、变应性鼻炎、变应性结膜炎、嗜酸粒细胞性食管炎、鼻息肉或它们的组合。

待检测的分析物通常是取自受试者、优选人受试者的血清的组分。样品中待检测和/或定量的代表性分析物包括但不限于细胞因子、蛋白质药物产品以及它们的代谢物或片段。

代表性的细胞因子包括白介素。白介素包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、il-34、il-35和il-36。在一个实施方案中，分析物是il-33。

代表性的蛋白质药物产品包括但不限于重组蛋白、抗体和融合蛋白。抗体可以是多反应性抗体或自身抗体(嗜异性抗体)、人抗动物抗体、或抗药物抗体。在一个实施方案中，蛋白质药物产品是抗il-33抗体。

2.il-33的配体

il-33的配体是与il-33非共价结合的分子，包括但不限于样品中的内源性组分诸如分析物的抗体或可溶性结合靶标、il-33的内源性配体，包括但不限于il-33的可溶性受体、il-33的可溶性配体和分析物的脱落受体。在一个实施方案中，il-33的配体是可溶性st2受体或可溶性辅助受体il-1受体辅助蛋白(il-1racp)。

st2(也称为il1rl1、der4、t1和fit-1)是toll样/il-1受体超家族的成员。该超家族的成员由共同的细胞内结构域，即toll/白介素1受体(tir)结构域限定。约160个氨基酸的这个结构域由位于该蛋白质胞质端的中央的五链β-片层构成，所述β-片层周围由五个α-螺旋围绕。toll样/il-1受体超家族可根据其胞外结构域分为三个亚家族：il-1受体样亚家族、toll受体亚家族和由它们的衔接蛋白组成的家族。

3.il-33复合物的酸变性

可将所公开的方法中的样品酸化1至60分钟。在一个实施方案中，将样品酸化1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分钟。

可用于酸化步骤的酸包括但不限于乙酸、盐酸和硫酸。

足以解离il-33复合物的ph可以为3.0至5.0。在一个实施方案中，ph为3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。

在一个实施方案中，可以将变性剂添加至样品中以解离il-33复合物，包括但不限于尿素。

4.阻断剂

所公开的方法中使用的阻断剂是已在酸化步骤中使il-33复合物解离后减少或防止il-33复合物在样品中重新形成的试剂。当从受试者例如人受试者获取样品时，样品通常含有待检测或定量的il-33复合物。阻断剂可以是与除il-33之外的il-33复合物组分免疫特异性结合的抗体。在一个实施方案中，阻断剂是抗st2抗体。

在一个实施方案中，阻断剂是与il-33药物产品结合的抗体，例如与抗il-33抗体结合的抗体。

5.检测试剂

所公开的方法中使用的检测试剂可以是il-33拮抗剂或抑制剂，例如抗il-33抗体，优选抗人il-33抗体或il-33陷阱蛋白。所述抗体可以是单克隆的、多克隆的或人源化的。

在一些实施方案中，用可检测标签标记检测试剂。可检测标签是本领域已知的，包括但不限于稀有过渡金属粒子、荧光团、发色团、量子点、贵金属纳米粒子、放射性部分、酶、生物素/亲和素标签和化学发光标签。在一个实施方案中，可检测标签是钌。

a.抗il-33拮抗剂

在某些实施方案中，可用于所公开的测定法和方法中的il-33拮抗剂或抑制剂是抗il-33抗体或特异性结合人il-33的抗体的抗原结合片段。在一个实施方案中，本文所述的用于所公开的方法和测定法的抗il-33抗体公开于美国专利no.10,000,564和no.9,453,072，将这些专利以引用的方式全文并入。

所公开的测定法和方法中使用的抗il-33抗体特异性结合il-33。术语“特异性结合(specificallybinds)”等意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。确定抗体是否特异性结合抗原的方法是本领域熟知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，本文所用的“特异性结合(specificallybinds)”il-33的抗体包括如在表面等离体共振测定法中所测量的，以小于约1000nm、小于约500nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约90nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm、小于约10nm、小于约5nm、小于约4nm、小于约3nm、小于约2nm、小于约1nm或小于约0.5nm的kd结合至il-33或其生物活性部分的抗体。然而，特异性结合人il-33的分离的抗体可能与其他抗原(诸如来自其他(非人)物种的il-33分子)具有交叉反应性。

在一些实施方案中，il-33拮抗剂是抗il-33抗体或其抗原结合片段(包含重链可变区(hcvr)、轻链可变区(lcvr)和/或互补决定区(cdr))，其包含如美国专利no.10,000,564和no.9,453,072中所示的抗il-33抗体的氨基酸序列中的任一者。在某些实施方案中，il-33拮抗剂是具有美国专利no.10,000,564和no.9,453,072中所述的参考抗体的结合特征的抗il-33抗体。

可用于本文所述的方法中的其他抗il-33抗体及其抗原结合片段公开于ep1725261和美国专利no.9,970,944、美国专利no.8,187,596、wo2011031600、wo2015099175和美国专利no.9,758,578、wo2015106080以及美国专利no.10,059,764(anb020)、us2016/0168242、wo2016/077381和美国专利no.10,093,730、wo2016/077366和us2018/0171405，或者wo2016/156440和us2018/0207265中，它们每一者均以引用的方式全文并入本文。

b.il-33陷阱蛋白

在一些实施方案中，可用于所公开的方法和测定法中的il-33拮抗剂或抑制剂是基于受体的il-33陷阱蛋白。示例性的il-33陷阱蛋白包括至少一个il-33结合结构域，该结构域含有il-33受体蛋白(例如st2)的il-33结合部分。在某些实施方案中，il-33陷阱蛋白还包括il-33辅助受体(例如il-1受体辅助蛋白或il-1racp)的胞外部分。il-33陷阱蛋白还可含有至少一个多聚化组分，其起到使陷阱蛋白的各种组分相互连接的作用。

在一个实施方案中，本文所述的用于所公开的方法和测定法的il-33陷阱蛋白公开于美国专利no.9,637,535和wo2014/152195中，将所述专利每一者以引用的方式全文并入本文。

一般来讲，il-33陷阱蛋白包括附接至多聚化结构域(m)的第一il-33结合结构域(d1)。在某些实施方案中，il-33拮抗剂包括附接至d1和/或m的第二il-33结合结构域(d2)。根据某些实施方案，d1包括st2蛋白的il-33结合部分。st2蛋白的il-33结合部分可包括st2蛋白的全部或部分胞外结构域或者由其组成。在某些实施方案中，st2蛋白是人st2蛋白。如本文所用，“人st2蛋白”是指如登录号np_057316.3的氨基酸1-556中所示的st2蛋白，将登录号np_057316.3以引用的方式全文并入。根据某些实施方案，d2包括il-1racp蛋白的胞外部分。

il-33陷阱蛋白的各个组分可相对于彼此以多种方式排列，从而产生能够结合il-33的功能性拮抗剂分子。例如，d1和/或d2可附接至m的n端。在其他实施方式中，d1和/或d2附接至m的c端。在其他实施例中，d1附接至d2的n端，并且d2附接至m的n端，从而导致由式d1-d2-m表示的拮抗剂分子从n端到c端的串联融合。

在某些实施方案中，il-33拮抗剂具有两个多聚化结构域，即m1和m2，其中m1和m2彼此相同。例如，m1可以是具有特定氨基酸序列的fc结构域，并且m2是具有与m1相同的氨基酸序列的fc结构域。

c.其他il-33拮抗剂

可充当il-33拮抗剂并且可用于所公开的方法和测定法的其他试剂包括免疫粘附素、肽体(peptibody)、可溶性st2、或它们的衍生物；抗il-33受体抗体(例如，抗st2抗体，例如amg-282(安进公司(amgen))或stlm15(詹森公司(janssen))或wo2012/113813和美国专利no.9,309,319、wo2013/173761和美国专利no.9,982,054、wo2013/165894和美国专利no.9,951,137、美国专利no.8,444,987或美国专利no.7,452,980中所述的抗st2抗体中的任一者，将这些专利每一者全文以引用方式并入本文。用于所公开的方法和测定法中的其他il-33拮抗剂包括st2-fc蛋白，诸如wo2013/173761和美国专利no.9,982,054、或者wo2013/165894和美国专利no.9,951,137中所述的那些，将这些专利每一者以引用的方式全文并入本文。

6.捕集试剂

在一个实施方案中，在所公开的方法和测定法中使用的捕集试剂是如上所述的il-33拮抗剂，例如抗体，优选抗il-33抗体，优选抗人il-33抗体。示例性的抗il-33抗体公开于美国专利no.10,000,564中，将该专利以引用的方式全文并入。上文描述了可使用的其他抗il-33抗体。在一个实施方案中，捕集试剂是生物素化的。

在一些实施方案中，将捕获试剂固定至或连接至固体支持物。固体支持物可以是微孔板，例如链霉亲和素包被的微孔板。

在一些实施方案中，捕集试剂是上述il-33拮抗剂。

c.伴随诊断

在一个实施方案中，所公开的用于检测和定量il-33的方法和测定法作为伴随诊断方法与设计用于降低正接受治疗的受试者中的il-33循环水平或用于提高正接受治疗的受试者中的il-33循环水平的治疗结合使用。所述治疗可包括施用il-33拮抗剂或施用il-33。示例性的il-33拮抗剂是上述的那些拮抗剂，并且包括但不限于抗il-33抗体、抗il-33融合蛋白、sst诱饵受体、或它们的组合。

一个实施方案提供了一种在正接受包括施用如上所述的il-33拮抗剂或施用il-33在内的治疗的受试者中监测il-33相关疾病的治疗的方法。用il-33抑制剂或il-33治疗的代表性疾病、障碍或病理包括但不限于哮喘、嗜酸粒细胞性或非嗜酸粒细胞性哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(copd)、炎性肠病、克罗恩氏病、结肠炎、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、关节炎、变应性鼻炎、特应性皮炎、嗜酸粒细胞性食管炎、牛皮癣、鼻息肉、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血性中风和纤维化病症包括但不限于掌筋膜挛缩症(dupuytren'sdisease)、粘连性关节囊炎、关节周围纤维化、瘢痕疙瘩或肥厚性瘢痕、子宫内膜异位、腹腔粘连、神经周围纤维化、跖部纤维瘤病(ledderhosedisease)、佩罗尼氏病(peyronie'sdisease)、腱鞘周围粘连和关节周围纤维化。

本文所述的方法和测定法可用于在用一种或多种含有如上所述的il-33拮抗剂的药物组合物(例如，特别是用与涉及il-33的作用机理有关的药物)、用抗炎疗法、或通过免疫吸附疗法治疗受试者之前和之后评估、检测或定量受试者中的循环il-33水平，或者其中在这种治疗后评估il-33并将il-33的浓度或量相对于预定的水平或相对于治疗前在受试者中测得的水平进行比较。治疗后观察到不利的il-33浓度或量证实该受试者将不会受益于进一步的或持续的治疗，而治疗后观察到有利的il-33浓度或量证实该受试者将会受益于进一步的或持续的治疗。

在一个实施方案中，来自接受并入了il-33抑制剂的治疗的受试者的样品中通过所公开的方法和测定法检测到的不利的il-33浓度是与治疗之前在受试者中测得的水平相同或更高的il-33水平。在一个实施方案中，来自接受并入了il-33抑制剂的治疗的受试者的样品上通过所公开的方法和测定法检测到的有利的il-33浓度是低于治疗之前在来自受试者的样品中测得的il-33水平的il-33水平。

在另一个实施方案中，来自接受并入了il-33的治疗的受试者的样品中使用所公开的方法和测定法检测到的不利的il-33浓度是低于治疗之前在来自受试者的样品中测得的il-33水平的水平。在另一个实施方案中，来自接受并入il-33的治疗的受试者的样品中使用所公开的方法和测定法检测到的有利的il-33浓度是高于治疗之前在来自受试者的样品中测得的il-33水平的il-33水平。

确认循环中的il-33水平有助于临床研究的管理，以及提供改善的患者护理。

iii.试剂盒

还提供了用于测定测试样品中il-33(或其片段)在样品中的存在、量或浓度的试剂盒。该试剂盒包括至少一种用于测定测试样品的il-33(或其片段)的组分和用于测定测试样品的il-33(或其片段)的说明书。

在一个实施方案中，试剂盒包括如上所述的检测试剂、如上所述的捕集试剂、固体支持物、其他试剂和用于进行该测定法的书面说明。检测试剂和捕集试剂可以是任选固定在固相上的相同的或不同的上述il-33拮抗剂，诸如单克隆抗体(或其片段、变体或变体的片段)、融合蛋白、il-33陷阱蛋白或适体(apatamer)。

检测试剂通常用可检测标签诸如化学发光标签标记。检测试剂可并入有本文所述的可检测标签，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/亲和素标签、发色团、化学发光标签等，或者试剂盒可包括用于进行用可检测标签标记的试剂。抗体、校准物和/或对照可以在单独的容器中提供或者可预先分配进合适的测定形式中，例如微量滴定板中。在一个实施方案中，用钌标记il-33检测试剂。

在某些实施方案中，试剂盒容纳有生物素标记的捕集试剂和链霉亲和素包被的固体支持物，例如微量滴定板或电化学发光平台。在一些实施方案中，捕集试剂和微量滴定板或电化学发光平台在单独的容器中提供。在其他实施方案中，试剂盒容纳有用捕集试剂包被的微量滴定板或电化学发光平台板。该试剂盒还容纳有如上所述的用于处理样品的酸溶液和缓冲液。

试剂盒可包括校准物或对照，例如分离的或纯化的il-33。试剂盒可包括至少一个用于进行该测定法的容器(例如，管、微量滴定板或条带或电化学发光平台)，和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液(其中任何一者均可以浓缩溶液提供)，用于可检测标签(例如酶标签)的底物溶液，或终止溶液。优选地，试剂盒包括进行该测定法所必需的所有组分，即试剂、标准品、缓冲液、稀释剂等。说明书可以是纸质形式或计算机可读形式。

任选地，该试剂盒包括质量控制组件(例如，灵敏度组(sensitivitypanel)、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域所熟知的，并且在用于各种免疫诊断产品的插页上进行了描述。灵敏度组成员任选用于确立测定法性能特征，并且还任选是该免疫测定试剂盒试剂的完整性和测定法标准化的有用指示剂。

试剂盒还可任选包括进行诊断测定法或帮助质量控制评价所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、酶底物、检测试剂等等。试剂盒中还可以包括其他成分，诸如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如，预处理试剂)。该试剂盒可另外包括一种或多种其他对照。试剂盒的一种或多种组分可以是冻干的，在这种情况下，试剂盒可还包含适合于冻干组分的重构的试剂。

如有必要，可任选将试剂盒的各种成分置于适当的容器，例如微量滴定板中。试剂盒可还包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于尿液样品的容器或筒)。在适当的情况下，试剂盒任选还可容纳有反应容器、混合容器和有助于制备试剂或测试样品的组件。该试剂盒还可以包括一种或多种用于协助获得测试样品的器械，诸如注射器、移液管、镊子、量匙等等。

实施例

实施例i：测定法形式

图1是用于检测il-33的示例性测定法的示意图。这种用于定量il-33的方法是在电化学发光平台上进行的夹心免疫测定法。该程序使用链霉亲和素包被的微孔板，并使用生物素化抗il-33抗体作为捕集试剂。该方法包括对血清样品进行酸预处理以解离样品中存在的可溶性配体:结合伴侣复合物并改善在存在结合伴侣(例如抗il-33治疗药物和/或可溶性st2)的情况下il-33的检测，从而提供总il-33水平的定量测量。然后将经酸化的样品在含有经标记的抗il-33检测抗体的碱性溶液中中和，在一个实施方案中，该抗体可以与可溶性st2受体和药物竞争结合il-33。

可以使用的示例性酸包括但不限于乙酸、硫酸和盐酸。可以使用缓冲碱性溶液(例如tris溶液)中和样品。

可以使用的示例性il-33抗体描述于美国专利no.10,000,564中，将该专利以引用的方式全文并入。可用于所公开的方法的其他抗il-33抗体包括但不限于美国专利no.9,758,578和美国专利申请公开2018/0037644中描述的那些。

在一个实施方案中，将标准品、对照和样品稀释于乙酸中，并用含有检测试剂(例如钌标记的抗人il-33抗体)的tris-碱溶液中和。还将抗il-33抗体和抗st2抗体添加至所述tris溶液，以最大程度地减少药物或内源性结合伴侣的干扰。然后将中和的标准品、对照和样品添加至所述板。通过读板仪根据在向板上施加电压时由钌标签生成的化学发光信号来测量在板上捕集的il-33。所得的电化学发光信号(即计数)与血清样品中存在的il-33的量成比例。

实施例ii：最大程度减少内源性结合伴侣干扰

材料和方法

使用4种不同的测定条件(如下所述)测试了重组人st2耐受性，其中对于所有的条件第一(捕集)步骤为将生物素化的抗il-33mab添加至链霉亲和素板。

对于逐步进行的测定法(捕集-分析物-检测，c-a-d)，首先将样品(含有分析物，即il-33)稀释于酸性溶液中并让其温育。板洗涤后，则将经酸化的样品进一步稀释于碱性中和缓冲液中，然后添加至测定板。在样品温育后，洗涤测定板并添加经标记的检测mab溶液。在检测试剂温育之后，洗涤板，添加缓冲液，并读板。还在无酸化步骤的情况下进行该测定法，其中将样品稀释于测定缓冲液中，然后将样品添加至测定板。

对于在同时添加分析物和检测剂(c-ad)的情况下进行的测定法，首先将样品稀释于酸性溶液中并让其温育。板洗涤后，则将经酸化的样品进一步稀释于含有经标记的检测mab的碱性中和缓冲液中，然后添加至测定板。在样品温育之后，洗涤板，添加缓冲液，然后读板。还在无酸化步骤的情况下进行该测定法，其中首先将样品稀释于测定缓冲液中，接着随后稀释于含有经标记的检测mab的测定缓冲液中，然后将样品添加至测定板。

在存在递增浓度的重组可溶性st2的情况下在如上所述的4种不同测定条件下测试了36pg/ml的重组il-33，如图2a中所示。

结果

对于在存在重组st2的情况下检测重组人il-33，酸处理是必要的。给c-a-d测定法添加酸处理步骤可将st2耐受性提高至约12ng/ml，通过使用具有酸处理的c-ad测定法形式，st2耐受性可进一步提高至>50ng/ml(图2a)。酸处理对于改善人血清中内源性il-33的检测也是必要的。当与c-a-d测定法形式相比时，使用c-ad测定法形式可改善内源性il-33的检测，这是由于减少了来自内源结合伴侣的测定法干扰(图2b)。

实施例iii：精确性和特异性：内源性il-33

材料和方法

通过在如实施例ii中所述的具有酸处理的c-ad测定法中分析2个不同个体的血清样品确认了对il-33的特异性，所述测定法在向含有检测试剂的碱性中和溶液中添加或不添加过量重组人st2或200μg/ml的抗il-33抗体的情况下测试。

使用如实施例ii中所述的具有酸处理的c-ad测定法测试了两个个体。数据代表在5个分开的日期进行的4次独立的重复测定。

结果

该测定法对于内源性il-33是特异性的，因为添加结合伴侣(如重组st2或抗il-33mab)至中和溶液可抑制il-33的检测。图3是柱状图，显示了内源il-33特异性。

该测定法展示出可接受的精度，对于个体1和个体3，变异系数百分比(％cv)分别为7.1和12.3。图4是显示该测定法在定量人血清中的内源性il-33中的精度的图。

实施例iv：在存在抗il-33mab的情况下检测il-33(抗il-33mab耐受性)

材料和方法

图5是示出了用于检测il-33的方法在存在抗il-33mab的情况下的耐受性的线图。在存在递增浓度的抗il-33mab的情况下，在实施例ii中所述的具有酸处理的c-ad方法中测试了90pg/ml的重组il-33，如图5中所示。通过将过量的抗药物mab和抗st2mab添加至中和溶液来改良所述测定法。

结果

酸处理对于在存在抗il-33mab的情况下检测人il-33很重要。将检测试剂添加至中和溶液中，以及添加抗药物mab和抗st2mab，可将该测定法中的抗il-33mab耐受性提高至>500μg/ml。

实施例v：正常个体和患病个体中的内源性il-33水平

材料和方法

从商业供应商处购买了各自来自4个不同群体的25个个体，并使用测定法即如实施例ii中所述的具有酸处理的c-ad测定法筛选内源性il-33。

结果

图6是来自正常个体和患有哮喘、copd和特应性皮炎的个体的血清中的内源性il-33(pg/ml)的图。所有测试的个体结果是il-33浓度低于31pg/ml。

实施例vi：人源化小鼠数据

材料和方法

将人源化il-33小鼠用室内尘螨(hdm)处理15周以作为人呼吸疾病的模型。示例性的人源化il-33小鼠公开于美国专利公开no.20170311580，将该专利以引用的方式全文并入。在如实施例iv中所述的具有酸处理的c-ad测定法的改良形式中测试样品。

结果

图7a和7b示出了来自经处理的小鼠和对照小鼠的人il-33(pg/ml)。在处理结束时盐水对照、hdm处理对照和同种型对照显示了相似的人il-33水平。给予抗il-33单克隆抗体的小鼠显示出血清il-33水平明显升高。

已开发出一种总人il-33测定法，其在纯血清中的灵敏度为12.5pg/ml。总体而言，数据表明酸处理步骤对于移除il-33内源性结合伴侣非常重要。向中和溶液添加检测抗体可改善重组/内源性st2耐受性。该测定法已展示对内源性人il-33的特异性。给予抗il-33抗体的hdm处理小鼠显示出人il-33升高，这是由于结合的靶标获得了该药物的半衰期，而hdm对照和同种型对照则看起来保持在基线。

尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有额外实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。

本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。