本发明属于化学分析
技术领域：
，涉及一种待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法。
背景技术：
：二巯基聚乙二醇残留量的测定方法有毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法等，也可采用紫外-可见光谱法或者荧光光谱法。然而，毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法，紫外光谱法的灵敏度和准确度比较低，但是这种方法简单、快速，并且反应条件温和，且可以同时测定总的自由巯基而被大家广泛采用。其中ellman试剂应用最为广泛，中国药典里面收载的蛋白质中自由巯基的含量测定方法即采用该法。但当该方法测定自由巯基的残留时，即测定某种物质中二巯基聚乙二醇的痕量时，该方法就存在灵敏度太低的问题。而在某些反应中，尤其该物质作为起始物料或中间物质时，由于多余二巯基聚乙二醇物质等，需要严格控制其残留。cn102759586a公开了一种高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，公开了甲酸在使用高效液相色谱分析法测定组合物中巯基化合物的含量时作为稳定剂的应用，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物该专利申请并不能准确检测残留的痕量自由巯基的含量。cn106770843a公开了一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，而后经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；利用已知自由巯基浓度的对照品溶液作为对照；通过供试品溶液的液相色谱峰面积与已知自由巯基浓度的对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。该专利申请利用了柱后衍生检测自由巯基含量，但是存在一系列问题。柱后衍生又称柱后反应(post-columnderivatization)，利用衍生反应使被测物与相应的试剂分析反应，以改变其物理或化学性质，使其被检测到。该方法存在以下缺陷：得到的二巯基聚乙二醇的色谱峰，对称因子和拖尾因子偏大，而且观察到峰形略有塌陷，这些色谱峰形的缺陷，都会使得检测结果的波动性偏大；衍生物和衍生剂均在色谱柱上不保留，这两种物质不能在色谱图上实现基线分离；在样品主峰的位置空白中有干扰，虽然目前可以用扣除空白的方法计算样品中的二巯基聚乙二醇的含量，但是比较繁琐。因此，需要提供一种新的关于二巯基聚乙二醇残留量的检测方法来满足应用要求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法。本发明提供的检测方法检测准确性高，检测灵敏度好。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法，所述检测方法包括利用超高效液相色谱法进行检测。相比于高效液相色谱法，本发明采用超高效液相色谱法对待测样品进行检测，具有改善峰形的有益效果。在本发明中，所述检测方法包括如下步骤：(1)将待测样品与衍生试剂混合进行衍生化反应；(2)将步骤(1)经过衍生后的待测样品利用超高效液相色谱法进行色谱分析，得到待测样品的色谱峰；(3)利用已知二巯基聚乙二醇的量的对照品经过与步骤(1)和步骤(2)所述待测样品相同的处理，得到对照品的色谱峰；(4)通过待测样品的色谱峰面积与对照品的色谱峰面积的比较、计算，得到所述待测样品中二巯基聚乙二醇残留量。在本发明中，通过柱前衍生化法，并且利用超高效液相色谱法，对待测样品中的二巯基聚乙二醇残留量进行检测分析，具有操作便捷，分析快速的有益效果。在本发明中，所述衍生试剂为磷酸钠-edta缓冲液，其中还包括5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。优选地，在所述衍生试剂中，所述磷酸钠的浓度为0.1m，ph为7.5、8.0、8.5。优选地，在所述衍生试剂中，所述5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的浓度为3.5-4.5mg/ml，例如3.7mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml等。优选地，所述待测样品以溶液的方式与衍生试剂混合。优选地，所述待测样品包括玻璃酸钠注射液。优选地，在待测样品溶液中，所述待测样品的浓度为2-200μg/ml，例如5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml等。优选地，所述衍生化反应中，所述磷酸钠、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和待测样品的质量比为(5-10):1:(5-10)。所述5-10可以是6、7、8、9等。本发明通过调整待测样品和衍生化试剂的配比，在本发明提供的范围内，具有操作便捷、分析快速的优点；若不在本发明限定的范围内，则测量偏差较大。优选地，所述衍生化反应的温度为室温，时间为15-30min，例如18min、20min、22min、25min、28min等。本发明通过调整衍生化反应的时间，可以使衍生反应在尽可能短的时间反应完全，若不在本发明的反应时间内，则可能会由于反应时间不够而导致反应不完全，或者由于反应时间过长而耗费时间。优选地，所述超高效液相色谱法中利用的色谱为亲水性色谱柱。先将待测样品进行衍生，衍生后的产物极性大，在一般的普通反相介质中保留行为不好，因此，本发明特异性的选择了亲水性液相色谱(hydrophilicinteractionliquidchromatography)进行分析，具有在促进衍生后的产物保留的同时也达到了分离衍生产物与反应体系中其他物质的效果。在本发明中，步骤(3)所述对照品中，所述二巯基聚乙二醇的量为2-200μg/ml，例如10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml等。本发明可以制备几种不同浓度的对照品，以期望检测结果的尽可能准确。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：(1)相比于高效液相色谱法，本发明采用超高效液相色谱法对待测样品进行检测，具有改善峰形的有益效果；(2)在本发明中，通过柱前衍生化法，并且利用超高效液相色谱法，对待测样品中的二巯基聚乙二醇残留量进行检测分析，具有操作便捷，分析快速的有益效果；(3)本发明特异性的选择了亲水性液相色谱进行分析，具有在促进衍生后的产物保留的同时也达到了分离衍生产物与反应体系中其他物质的效果；(4)本发明提供的检测方法具有准确性高、精密度好的特点。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1一种待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法如下：(1)将200μg待测样品溶于1ml磷酸盐缓冲液中，得到待测溶液；(2)将0.1m的磷酸钠-edta缓冲液与4mg/ml的dtnb溶液(溶于0.1m的磷酸钠)按照体积比5:1混合，得到衍生试剂；(3)将250μl的待测溶液与250μl衍生试剂混合，在室温下反应20min；(4)将经过衍生后的待测样品利用超高效液相色谱法进行色谱分析，得到待测样品的色谱峰；(5)利用已知二巯基聚乙二醇含量的对照品经过与步骤(1)-(4)待测样品相同的处理，得到对照品的色谱峰；其中，对照品中二巯基聚乙二醇含量分别为2μg/ml、20μg/ml、200μg/ml；(6)通过待测样品的色谱峰面积与对照品的色谱峰面积的比较、计算，得到所述待测样品中二巯基聚乙二醇残留量。色谱条件：色谱柱：watersbehhilic2.1×150mm，1.7μm；流动相：a：水；b：乙腈；柱温：60℃梯度：时间(min)a％b％起始3970.53971.540601.9406023973397实施例2-3与实施例1的区别在于，步骤(3)中的反应时间为10min(实施例2)、30min(实施例3)。实施例4与实施例1的区别在于，步骤(2)中0.1m的磷酸钠-edta缓冲液与dtnb溶液的体积比为10:1。对比例1与实施例1的区别在于，采用hplc级的c18色谱柱，乙腈：甲醇(v:v,80:20)为流动相进行等度洗脱。对比例2与实施例1的区别在于，采用柱后反应进行检测。柱后反应液：0.15mg/ml的dtnb溶液，现用现配。柱后反应条件：柱后反应管为聚四氟乙烯管(0.5mm×10m)，线圈温度30℃，柱后反应液流速：0.5ml/min。由实施例1和实施例2-3的对比可知，当反应时间为20min时，效果最好；由实施例1和实施例4的对比可知，当0.1m的磷酸钠-edta缓冲液与dtnb溶液的体积比为5:1时，效果最佳。对比例1提供的检测方法的时间在5min以上，而本发明提供的分析方法在2min以内即可完成二巯基聚乙二醇残留量的检测，因此，由实施例1和对比例1的对比可知，本发明提供的检测方法可以缩短分析检测时间，同时亲水色谱方法相比反相色谱可以改善衍生产物的保留。实施例1和对比例2对比可知，本发明采用的柱前衍生的方式可以避免柱后反应的复杂性，避免柱后反应装置损坏对检测造成影响，更好的提高效率。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的待测样品中二巯基聚乙二醇残留量的检测方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品涉及各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12