一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法与流程
本发明涉及临床检验领域，尤其涉及一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
背景技术：
lp-pla2是一种能够促进炎症反应的生化指标，在血浆中以组成活性形式循环。lp-pla2由炎症细胞分泌，包括单核细胞来源的巨噬细胞、t细胞和肥大细胞，主要与ldl-c结合。它是磷脂酶a2超家族的成员之一，具有水解磷脂底物sn-2酯键的能力。lp-pla2的催化活性被认为是脂蛋白依赖性的，它的活性更多地集中在小而致密的ldl胆固醇上，包括被认为是最容易引起动脉粥样硬化的lp(a)颗粒。除能水解血小板活化因子外，该酶对包括氧化磷脂和短链磷脂等多种极性磷脂具有特异性。因为这一作用机制，lp-pla2在脂蛋白相关的氧化磷脂的代谢、修饰中起着重要作用，对血管炎症反应具有高的敏感性和特异性特点。lp-pla2是一种由四百多个氨基酸残基组成的酶，人体血浆中的lp-pla2主要是和富含apo-b的脂蛋白相结合，低密度脂蛋白占4/5。当lp-pla2和hdl结合时，lp-pla2能够降解血小板活化因子，抑制血小板活化反应，从而抑制动脉粥样硬化的发展；但是，结合了ldl-c的lp-pla2可水解和氧化ldl-c，最终使得内皮细胞功能受损、凋亡，致使更多促炎活性物质生成，促使粥样硬化斑块的生成和进展，是冠心病的预测生化指标。既往国外众多研究结果均提示：伴随着lp-pla2浓度的升高，冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病人群也会逐渐增加。此外，lp-pla2浓度升高与冠状动脉粥样硬化性心脏病病人心血管事件复发率相关。众多研究表明，lp-pla2水平和冠状动脉粥样硬化性心脏病发生风险存在正相关性，并且不受其它危险因素干扰。
抗体的基本单位是“y”字型结构的ig单体，含有两条h链和两条l链，igh链和l链中靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variableregion,v)，重链和轻链的v区分别称为vh和vl。vh和vl中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariableregion，hvr)或互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)，包括hvrl(cdrl)、hvr2(cdr2)和hvr3(cdr3)，其中，hvr3(cdr3)氨基酸序列可变程度更高，vh和vl的3个cdr共同组成ig的抗原结合部位(antigen-bindingsite)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。单链抗体(singlechainantibodyfragment，scfv)是由抗体vh和vl通过15-20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。
目前，检测lp-pla2的原理基于酶活性检测和抗原抗体反应，常用的方法是比色法、化学发光法、酶联免疫法。其中，比色法成本高，且反应干扰较大；化学发光检测成本高；酶联免疫法的特异性和灵敏度都较低，且检测周期较长，操作繁琐，不便于临床检测大规模使用。因此，目前急需一种成本低、特异性与灵敏度高，并且检测周期短、操作简单，适于临床检测大规模使用的lp-pla2检测方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种成本低、特异性与灵敏度高，并且检测周期短、操作简单，适于临床检测大规模使用的基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；
所述试剂r1包括的成分及相应含量为：nah2po41.00-5.00g/l，na2hpo410.00-50.00g/l，nacl3.00-20.00g/l，mgcl20.10-5.00g/l，peg60005.00-29.00g/l，nan30.1-5g/l，溶剂为纯化水；
所述试剂r2包括的成分及相应含量为：nah2po41.00-5.00g/l，na2hpo410.00-50.00g/l，nacl3.00-20.00g/l，明胶0.1-1.0g/l，曲拉通-1000.01％-1.00％，bsa10.00-100.00g/l，nan30.1-5g/l，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒1.0-10.0％，溶剂为纯化水；
其中，所述试剂r2中，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人lp-pla2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1包括的成分及相应含量具体为：nah2po42.86g/l，na2hpo428.65g/l，nacl6.87g/l，mgcl20.34g/l，peg600016.00g/l，nan31.00g/l，溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2包括的成分及相应含量具体为：nah2po42.86g/l，na2hpo428.65g/l，nacl9.00g/l，明胶0.5g/l，曲拉通-1000.05％，bsa50.00g/l，nan31.00g/l，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒5.0％，溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的获取方法如下：
(1)将1-5g直径大小为100-150nm的羧基化的乳胶微球加入到50ml的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺100-300mg/l的ph6.0的0.1-0.5mol/l的mes缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25ml/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/l的磷酸盐缓冲液5ml混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/l的磷酸盐缓冲液25ml混匀；
(3)每管加入重组抗人lp-pla2单链抗体10-100mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有1-30g/l的6-氨基己酸ph8.0的磷酸盐缓冲液10ml；
(5)每管液体加小牛白蛋白0.1-4.0g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒。
作为本发明的优选方式之一，所述重组抗人lp-pla2单链抗体的获取方法如下：
(1)设计lp-pla2cds序列特异性引物：人lp-pla2基因引物序列的上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示；lp-pla2人工序列全序列如seqidno.3所示；其中，上游引物带有ncoi酶切位点，下游引物带有ecorv酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；
(2)从人全血中提取基因组dna，进行pcr扩增反应，获得pcr扩增产物；
(3)克隆载体制备；
(4)表达载体制备；
(5)表达菌制备；
(6)重组人lp-pla2的表达；
(7)将表达产物进行纯化和鉴定；
(8)balb/c小鼠免疫达到指定抗体水平后取脾脏，制备杂交瘤细胞；
(9)筛选抗lp-pla2阳性的细胞株，扩大培养，收获阳性细胞；
(10)提取阳性细胞的总rna，使用小鼠ig简并引物扩增出小鼠ig轻重链可变区；
(11)测序获得该lp-pla2单克隆抗体的基因序列，针对该vh和vl设计overlappcr引物和设计轻重链上下游引物：轻链上游引物的序列如seqidno.4所示，轻链下游引物的序列如seqidno.5所示；重链上游引物的序列如seqidno.6所示，重链下游引物的序列如seqidno.7所示；其中，轻链上游引物带有ncoi酶切位点，重链下游引物带有ecorv酶切位点，轻链上游引物和重链下游引物均带有肠激酶酶切位点；并且，轻链下游引物和重链上游引物均含有柔性linker，柔性linker的序列如seqidno.8所示；
(12)使用上述提取的阳性细胞的总rna逆转录产物cdna为模板扩增出vh-vl的融合基因片段；
(13)重组抗人lp-pla2单链抗体的表达；
(14)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品的制备；
(15)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品纯化。
一种上述基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
一、抗人lp-pla2重组单链抗体的制备
(1)设计lp-pla2cds序列特异性引物：人lp-pla2基因引物序列的上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示；lp-pla2人工序列全序列如seqidno.3所示；其中，上游引物带有ncoi酶切位点，下游引物带有ecorv酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；引物由华大基因进行合成；
(2)从人全血中提取基因组dna,进行pcr扩增反应：采用大连宝生物公司dna提取试剂盒takaraminibestwholebloodgenomicdnaextractionkit从人全血中提取dna，使用大连宝生物公司takaralapcrtmkitver.2.1，利用合成的引物进行pcr反应；pcr反应条件“95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min”,获得pcr扩增产物；
(3)克隆载体制备：pcr产物经测序无误后使用连接酶连接到克隆载体pmd-18t中，导入到克隆菌感受态细胞dh5α中；
(4)表达载体制备：lb培养基37℃培养过夜，使用大连宝生物公司质粒提取试剂盒takaraminibestplasmidpurificationkitver.4.0提取质粒，ncoi酶和ecorv酶进行双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将1293bp大小片段切下使用大连宝生物公司胶回收试剂盒takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0回收dna，将回收的dna使用连接酶连接到pet32a上，并导入bl21大肠埃希菌感受态细胞中；
(5)表达菌制备：lb培养基37℃220rpm摇菌2h，涂布于含氨苄青霉素的lb培养基平板培养过夜，取lb平板上生长的菌落经pcr鉴定目的基因，鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pet-32a/rlp-pla2；
(6)重组人lp-pla2的表达：挑取pet-32a/rlp-pla2工程菌于含氨苄青霉素50μg/ml的lb培养基中37℃摇菌1h来复苏工程菌活性，后在含50μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中放大培养8h；之后测od值达到1.5时，加入ipt，28℃诱导表达5h；收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带his标签的目的蛋白rlp-pla2；
(7)将表达产物进行纯化和鉴定：
离心收集细菌，加入质量体积比1:5的pbs重悬沉淀，-80℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400w，工作3s，间隔3s，超声破碎15min，重复3次，于4℃、12000r/min离心15min分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；
肠激酶酶切：将粗制蛋白使用大连宝生物公司肠激酶于23℃，酶切过夜；
亲和层析：将酶切后粗制蛋白过滤处理后过gst亲和层析柱，用第一elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2峰；所述第一elutionbuffer的配方为：60mmtris-cl、50mm还原性谷胱甘肽，ph7.0；
脱盐、缓冲液置换：将第一步纯化的rlp-pla2过脱盐柱，用置换缓冲液置换，准备下一步离子交换层析；所述置换缓冲液的配方为：60mmtris-cl，ph9.0；
离子交换层析：分别用loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第二elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2峰；所述loadingbuffer的配方为：60mmtris-cl，ph7.0；所述第二elutionbuffer的配方为：60mmtris-cl、0.8mnacl，ph7.0；
分子筛层析：离子交换层析收集到的rlp-pla2过分子筛层析柱，第三elutionbuffer收集rlp-pla2峰；所述第三elutionbuffer的配方为：60mmna2hpo4、0.2mnacl，ph7.0；
取收集rlp-pla2做werstenblot验证：使用abcam公司lp-pla2鼠单克隆抗体为抗体，使用abcam公司hrp标记的山羊抗鼠igg为第二抗体做wb，沉淀与上清样本在47kd处均有阳性条带，表明纯化后所得rlp-pla2为lp-pla2；
(8)制备杂交瘤细胞：8-ag选择性培养基筛选依赖型sp2/0细胞；脾脏制备成单个悬浮细胞，分别计数，取含1×108个脾细胞和2×107个sp2/0细胞的悬液加入同一支50ml离心管中，补加不完全培液至30ml；充分混匀，1500r/min离心15min，吸去上清，将沉积的融合细胞悬浮在200ml的hat培养基中；将细胞接种到10个96孔平底细胞板，每孔0.2ml；置37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；
(9)筛选抗lp-pla2阳性的细胞株，扩大培养，收获阳性细胞：用rlp-pla2抗原1μg/ml包被酶标板，每孔100μl；用含有10％小牛血清的封闭液于37℃封闭60min；.用含有0.05％吐温的pbst洗涤液洗涤3次，5min/次；取杂交瘤上清液100μl加入包被板中，置湿盒37℃孵育60min；用pbst液洗涤3次，5min/次；加入hrp标记的羊抗鼠igg，每孔100μl，置湿盒37℃孵育60min；用pbst液洗涤3次，5min/次；加入opd底物液，100μl/孔,置室温15min观察；当阳性对照孔出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50ul终止反应，测定各孔od值；选取阳性孔杂交瘤细胞，将其克隆化并扩大培养；取细胞培养上清作为一抗，使用hrp标记的abcam山羊抗鼠igg作为二抗，使用已验证的rlp-pla2作为抗原，使用abcam抗人lp-pla2单克隆抗体作为参照一抗，经wb验证该融合杂交瘤细胞为抗rlp-pla2阳性；
(10)提取阳性细胞的总rna，使用小鼠ig简并引物扩增出小鼠ig轻重链可变区：取上述阳性杂交瘤细胞使用大连宝生物公司rna提取试剂盒提取rna,逆转录，使用novagen公司的小鼠ig简并引物扩增出小鼠igg轻重链可变区；连接pmd-18t克隆载体，导入dh5α感受态细胞中，发酵提取质粒，送测序公司进行轻重链可变区基因的测序，确定轻重链可变区的基因序列；
(11)测序获得该lp-pla2单克隆抗体的基因序列，针对该vh和vl设计overlappcr引物和设计轻重链上下游引物：轻链上游引物的序列如seqidno.4所示，轻链下游引物的序列如seqidno.5所示；重链上游引物的序列如seqidno.6所示，重链下游引物的序列如seqidno.7所示；其中，轻链上游引物带有ncoi酶切位点，重链下游引物带有ecorv酶切位点，轻链上游引物和重链下游引物均带有肠激酶酶切位点；并且，轻链下游引物和重链上游引物均含有柔性linker，柔性linker的序列如seqidno.8所示；
(12)使用上述提取的阳性细胞的总rna逆转录产物cdna为模板扩增出vh-vl的融合基因片段：以上述逆转录所得cdna为模板，分别以轻链上下游引物、重链上下游引物进行pcr，得到pcr产物，记为l和h；以轻链上游引物和重链下游引物，以l和h为模板进行overlappcr，得到pcr产物，记为vlh；将vlh使用连接酶连接到pmd-18t克隆载体，导入dh5α感受态细胞中，发酵提取质粒送测序公司进行重组基因的测序，确定重组基因片段的序列，记为rlp-pla2-ab，符合设计序列；将上述rlp-pla2-ab基因经双酶切后与双酶切后的pet-32a(+)表达载体使用t4连接酶连接，导入到bl-21感受态表达菌中，即为目的表达载体；
(13)重组抗人lp-pla2单链抗体的表达：挑取上述工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的lb培养基中，37℃摇菌1h复苏工程菌活性，后在含氨苄青霉素100μg/ml的lb培养基中放大培养4h后，测od值达到1.0时，加入iptg；32℃诱导表达8h，收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带his标签的目的蛋白rlp-pla2-ab；
(14)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品的制备：离心收集细菌，加入质量体积比1:5的pbs重悬沉淀，-80℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400w，工作3s，间隔3s，超声破碎15min，重复3次，于4℃、12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；
(15)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品纯化：
肠激酶酶切：将粗制单链抗体使用大连宝生物公司肠激酶于23℃酶切过夜；
亲和层析：将酶切后粗制蛋白过滤处理后过gst亲和层析柱，用第四elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2-ab波峰；所述第四elutionbuffer的配方为：50mmtris-cl、40mm还原性谷胱甘肽，ph7.0；
脱盐、缓冲液置换：将上述纯化的rlp-pla2-ab过脱盐柱，用第二置换缓冲液置换，准备下一步离子交换层析；所述第二置换缓冲液的配方为：50mmtris-cl，ph6.0；
离子交换层析：分别用第二loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第五elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2-ab波峰；所述第二loadingbuffer的配方为：50mmtris-cl，ph6.0；所述第五elutionbuffer的配方为：50mmtris-cl、1mnacl，ph6.0；
分子筛层析：离子交换层析收集到的rlp-pla2-ab过分子筛层析柱，第六elutionbuffer收集rlp-pla2-ab峰；所述第六elutionbuffer的配方为：50mmna2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
取收集rlp-pla2-ab做werstenblot验证：使用上述制备的rlp-pla2为抗原，上述收集的rlp-pla2-ab为第一抗体，使用hrp标记的abcam公司山羊抗鼠igg为第二抗体做wb，在47kd处有阳性条带产生，表明单链抗体rlp-pla2-ab制备成功；
二、重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的制备
(1)将1-5g直径大小为100-150nm的羧基化的乳胶微球加入到50ml的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺100-300mg/l的ph6.0的0.1-0.5mol/l的mes缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25ml/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/l的磷酸盐缓冲液5ml混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/l的磷酸盐缓冲液25ml混匀；
(3)每管加入制备得到的重组抗人lp-pla2单链抗体10-100mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有1-30g/l的6-氨基己酸ph8.0的磷酸盐缓冲液10ml；
(5)每管液体加小牛白蛋白0.1-4.0g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒；
三、配制试剂r1
按照试剂r1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
四、配制试剂r2
按照试剂r2的组分含量，将制得的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。
一种上述基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取10μl样本，加入240μl试剂r1，反应5min，读点a1；
(2)再加入80μl试剂r2，反应5min，读点a2；
(3)计算吸光度变化值δa，根据吸光度变化值δa计算出样本中lp-pla2含量。
本发明检测的原理是：利用抗原抗体反应，先加入试剂r1，使血清中的lp-pla2的位点暴露，当加入抗人的lp-pla2胶乳颗粒溶液，使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物，从而产生一定的浊度，在人血清中lp-pla2的含量在一定的范围内lp-pla2的含量与浊度成正比；再通过标准曲线进行计算，从而得到lp-pla2的含量。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明建立了一种价格低廉的能够大量应用于临床检测的方法，通过自制的重组单链lp-pla2抗体与胶乳颗粒偶联，采用胶乳增强比浊法来测定人体血清中lp-pla2的含量，不需要预处理标本，操作简单，准确度高，重复性好，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪上使用；
(2)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，最低检测能够达到0.1ng/l，操作简单、快速，从检测到出结果最多只需要10min，甚至更短；
(3)本发明的试剂盒的试剂r2中的抗体乳胶的制备由于采用的化学偶联法，稳定性好，在2-8℃至少可以保存12个月；
(4)本发明试剂盒与elisa试剂盒对样品中lp-pla2含量检测的数据，经统计分析，无显著性差异，检测结果可靠，在临床上可以替代elisa试剂或者化学发光试剂，大幅降低成本以及检测时间。
附图说明
图1是实施例7中相应产物的westernblot鉴定图(图1中，泳道m：蛋白marker26616；泳道1：pet32a空载对照；泳道2：自制重组lp-pla2为抗原，abcam单克隆抗体为一抗；泳道3：abcam重组lp-pla2位抗原，自制单链抗体为一抗)；
图2是实施例9中本发明测定试剂盒的lp-pla2校准曲线图；
图3是实施例10中本发明试剂盒的拟合曲线图；
图4是实施例10中本发明试剂盒与酶联免疫方法试剂盒的相关性曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
试剂r1包括的成分及相应含量为：nah2po41.00g/l，na2hpo410.00g/l，nacl3.00g/l，mgcl20.10g/l，peg60005.00g/l，nan30.1g/l，溶剂为纯化水。
试剂r2包括的成分及相应含量为：nah2po41.00g/l，na2hpo410.00g/l，nacl3.00g/l，明胶0.1g/l，曲拉通-1000.01％，bsa10.00g/l，nan30.1g/l，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒1.0％，溶剂为纯化水。
其中，试剂r2中，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人lp-pla2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。
实施例2
本实施例的一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
试剂r1包括的成分及相应含量为：nah2po45.00g/l，na2hpo450.00g/l，nacl20.00g/l，mgcl25.00g/l，peg600029.00g/l，nan35g/l，溶剂为纯化水。
试剂r2包括的成分及相应含量为：nah2po45.00g/l，na2hpo450.00g/l，nacl20.00g/l，明胶1.0g/l，曲拉通-1001.00％，bsa100.00g/l，nan35g/l，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒10.0％，溶剂为纯化水。
其中，试剂r2中，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人lp-pla2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。
实施例3
本实施例的一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
试剂r1包括的成分及相应含量为：nah2po42.86g/l，na2hpo428.65g/l，nacl6.87g/l，mgcl20.34g/l，peg600016.00g/l，nan31.00g/l，溶剂为纯化水。
试剂r2包括的成分及相应含量为：nah2po42.86g/l，na2hpo428.65g/l，nacl9.00g/l，明胶0.5g/l，曲拉通-1000.05％，bsa50.00g/l，nan31.00g/l，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒5.0％，溶剂为纯化水。
其中，试剂r2中，重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人lp-pla2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。
实施例4
本实施例的一种上述实施例1-3中重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1g直径大小为100nm的羧基化的乳胶微球加入到50ml的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺100-300mg/l的ph6.0的0.1mol/l的mes缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25ml/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液5ml混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液25ml混匀；
(3)每管加入制备得到的重组抗人lp-pla2单链抗体10mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有1g/l的6-氨基己酸ph8.0的磷酸盐缓冲液10ml；
(5)每管液体加小牛白蛋白0.1g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒。
实施例5
本实施例的一种上述实施例1-3中重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将5g直径大小为150nm的羧基化的乳胶微球加入到50ml的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺300mg/l的ph6.0的0.5mol/l的mes缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25ml/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.5mol/l的磷酸盐缓冲液5ml混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.5mol/l的磷酸盐缓冲液25ml混匀；
(3)每管加入制备得到的重组抗人lp-pla2单链抗体100mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有30g/l的6-氨基己酸ph8.0的磷酸盐缓冲液10ml；
(5)每管液体加小牛白蛋白4.0g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒。
实施例6
本实施例的一种上述实施例1-3中重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2g直径大小为120nm的羧基化的乳胶微球加入到50ml的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺200mg/l的ph6.0的0.4mol/l的mes缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25ml/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.4mol/l的磷酸盐缓冲液5ml混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.2mol/l的磷酸盐缓冲液25ml混匀；
(3)每管加入制备得到的重组抗人lp-pla2单链抗体25mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有10g/l的6-氨基己酸ph8.0的磷酸盐缓冲液10ml；
(5)每管液体加小牛白蛋白3.2g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒。
实施例7
本实施例的一种上述实施例4-6中抗人lp-pla2重组单链抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)设计lp-pla2cds序列特异性引物：人lp-pla2基因引物序列的上游引物序列如seqidno.1所示，下游引物序列如seqidno.2所示；lp-pla2人工序列全序列如seqidno.3所示；其中，上游引物带有ncoi酶切位点，下游引物带有ecorv酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；引物由华大基因进行合成；
(2)从人全血中提取基因组dna,进行pcr扩增反应：采用大连宝生物公司dna提取试剂盒takaraminibestwholebloodgenomicdnaextractionkit从人全血中提取dna，使用大连宝生物公司takaralapcrtmkitver.2.1，利用合成的引物进行pcr反应；pcr反应条件“95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min”,获得pcr扩增产物；
(3)克隆载体制备：pcr产物经测序无误后使用连接酶连接到克隆载体pmd-18t中，导入到克隆菌感受态细胞dh5α中；
(4)表达载体制备：lb培养基37℃培养过夜，使用大连宝生物公司质粒提取试剂盒takaraminibestplasmidpurificationkitver.4.0提取质粒，ncoi酶和ecorv酶进行双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将1293bp大小片段切下使用大连宝生物公司胶回收试剂盒takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0回收dna，将回收的dna使用连接酶连接到pet32a上，并导入bl21大肠埃希菌感受态细胞中；
(5)表达菌制备：lb培养基37℃220rpm摇菌2h，涂布于含氨苄青霉素的lb培养基平板培养过夜，取lb平板上生长的菌落经pcr鉴定目的基因，鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pet-32a/rlp-pla2；
(6)重组人lp-pla2的表达：挑取pet-32a/rlp-pla2工程菌于含氨苄青霉素50μg/ml的lb培养基中37℃摇菌1h来复苏工程菌活性，后在含50μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中放大培养8h；之后测od值达到1.5时，加入ipt，28℃诱导表达5h(终浓度100μg/ml)；收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带his标签的目的蛋白rlp-pla2；
(7)将表达产物进行纯化和鉴定：
离心收集细菌，加入质量体积比1:5的pbs重悬沉淀，-80℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400w，工作3s，间隔3s，超声破碎15min，重复3次，于4℃、12000r/min离心15min分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；
肠激酶酶切：将粗制蛋白使用大连宝生物公司肠激酶于23℃，酶切过夜；
亲和层析：将酶切后粗制蛋白过滤处理后过gst亲和层析柱，用第一elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2峰；所述第一elutionbuffer的配方为：60mmtris-cl、50mm还原性谷胱甘肽，ph7.0；
脱盐、缓冲液置换：将第一步纯化的rlp-pla2过脱盐柱，用置换缓冲液置换，准备下一步离子交换层析；所述置换缓冲液的配方为：60mmtris-cl，ph9.0；
离子交换层析：分别用loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第二elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2峰；所述loadingbuffer的配方为：60mmtris-cl，ph7.0；所述第二elutionbuffer的配方为：60mmtris-cl、0.8mnacl，ph7.0；
分子筛层析：离子交换层析收集到的rlp-pla2过分子筛层析柱，第三elutionbuffer收集rlp-pla2峰；所述第三elutionbuffer的配方为：60mmna2hpo4、0.2mnacl，ph7.0；
取收集rlp-pla2做werstenblot验证：使用abcam公司lp-pla2鼠单克隆抗体(ab234703)为抗体，使用abcam公司hrp标记的山羊抗鼠igg为第二抗体做wb，沉淀与上清样本在47kd处均有阳性条带，表明纯化后所得rlp-pla2为lp-pla2(如图1的泳道2所示)；
(8)balb/c小鼠免疫达到指定抗体水平后取脾脏，制备杂交瘤细胞：
balb/c小鼠的免疫：取10mlrlp-pla2抗原(2mg/ml)与等量弗氏完全佐剂充分匀浆形成稳定乳液(记为乳化抗原)。每只小鼠腹腔注射0.5ml乳化抗原,免疫20只小鼠，第7日使用乳化抗原加强免疫一次，第14日使用乳化抗原加强免疫一次，第28日使用乳化抗原加强免疫一次，第42日使用未乳化的纯抗原再次进行加强免疫，第45日摘除眼球取血,处死小鼠，取脾脏；
融合细胞的制备：8-ag选择性培养基筛选依赖型sp2/0细胞；脾脏制备成单个悬浮细胞，分别计数，取含1×108个脾细胞和2×107个sp2/0细胞的悬液加入同一支50ml离心管中，补加不完全培液至30ml；充分混匀，1500r/min离心15min，吸去上清，将沉积的融合细胞悬浮在200ml的hat培养基中；将细胞接种到10个96孔平底细胞板(96孔板)，每孔0.2ml；置37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养；
(9)筛选抗lp-pla2阳性的细胞株，扩大培养，收获阳性细胞：用rlp-pla2抗原1μg/ml包被酶标板，每孔100μl；用含有10％小牛血清的封闭液于37℃封闭60min；.用含有0.05％吐温的pbst洗涤液洗涤3次，5min/次；取杂交瘤上清液100μl加入包被板中，置湿盒37℃孵育60min；用pbst液洗涤3次，5min/次；加入hrp标记的羊抗鼠igg(1:2000倍稀释)，每孔100μl，置湿盒37℃孵育60min；用pbst液洗涤3次，5min/次(每次实验均设阴性、阳性、空白对照各3孔)；加入opd底物液，100μl/孔,置室温15min观察；当阳性对照孔出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50ul终止反应，测定各孔od值；选取阳性孔杂交瘤细胞，将其克隆化并扩大培养；取细胞培养上清作为一抗，使用hrp标记的abcam山羊抗鼠igg作为二抗，使用已验证的rlp-pla2作为抗原，使用abcam抗人lp-pla2单克隆抗体作为参照一抗，经wb验证该融合杂交瘤细胞为抗rlp-pla2阳性；
(10)提取阳性细胞的总rna，使用小鼠ig简并引物扩增出小鼠ig轻重链可变区：取上述阳性杂交瘤细胞使用大连宝生物公司rna提取试剂盒提取rna,逆转录，使用novagen公司的小鼠ig简并引物扩增出小鼠igg轻重链可变区；连接pmd-18t克隆载体，导入dh5α感受态细胞中，发酵提取质粒，送测序公司进行轻重链可变区基因的测序，确定轻重链可变区的基因序列；
(11)测序获得该lp-pla2单克隆抗体的基因序列，针对该vh和vl设计overlappcr引物和设计轻重链上下游引物：轻链上游引物的序列如seqidno.4所示，轻链下游引物的序列如seqidno.5所示；重链上游引物的序列如seqidno.6所示，重链下游引物的序列如seqidno.7所示；其中，轻链上游引物带有ncoi酶切位点，重链下游引物带有ecorv酶切位点，轻链上游引物和重链下游引物均带有肠激酶酶切位点；并且，轻链下游引物和重链上游引物均含有柔性linker，柔性linker的序列如seqidno.8所示；
(12)使用上述提取的阳性细胞的总rna逆转录产物cdna为模板扩增出vh-vl的融合基因片段：以上述逆转录所得cdna为模板，分别以轻链上下游引物、重链上下游引物进行pcr，得到pcr产物，记为l和h；以轻链上游引物和重链下游引物，以l和h为模板进行overlappcr，得到pcr产物，记为vlh；将vlh使用连接酶连接到pmd-18t克隆载体，导入dh5α感受态细胞中，发酵提取质粒送测序公司进行重组基因的测序，确定重组基因片段的序列，记为rlp-pla2-ab，符合设计序列；将上述rlp-pla2-ab基因经双酶切后与双酶切后的pet-32a(+)表达载体使用t4连接酶连接，导入到bl-21感受态表达菌中，即为目的表达载体；
(13)重组抗人lp-pla2单链抗体的表达：挑取上述工程菌于含氨苄青霉素100μg/ml的lb培养基中，37℃摇菌1h复苏工程菌活性，后在含氨苄青霉素100μg/ml的lb培养基中放大培养4h后，测od值达到1.0时，加入iptg；32℃诱导表达8h(终浓度100μg/ml)，收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带his标签的目的蛋白rlp-pla2-ab；
(14)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品的制备：离心收集细菌，加入质量体积比1:5的pbs重悬沉淀，-80℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400w，工作3s，间隔3s，超声破碎15min，重复3次，于4℃、12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；
(15)重组抗人lp-pla2单链抗体粗制品纯化：
肠激酶酶切：将粗制单链抗体使用大连宝生物公司肠激酶于23℃酶切过夜；
亲和层析：将酶切后粗制蛋白过滤处理后过gst亲和层析柱，用第四elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2-ab波峰；所述第四elutionbuffer的配方为：50mmtris-cl、40mm还原性谷胱甘肽，ph7.0；
脱盐、缓冲液置换：将上述纯化的rlp-pla2-ab过脱盐柱，用第二置换缓冲液置换，准备下一步离子交换层析；所述第二置换缓冲液的配方为：50mmtris-cl，ph6.0；
离子交换层析：分别用第二loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第五elutionbuffer梯度洗脱，收集rlp-pla2-ab波峰；所述第二loadingbuffer的配方为：50mmtris-cl，ph6.0；所述第五elutionbuffer的配方为：50mmtris-cl、1mnacl，ph6.0；
分子筛层析：离子交换层析收集到的rlp-pla2-ab过分子筛层析柱，第六elutionbuffer收集rlp-pla2-ab峰；所述第六elutionbuffer的配方为：50mmna2hpo4、0.15mnacl，ph7.0；
取收集rlp-pla2-ab做werstenblot验证：使用上述制备的rlp-pla2为抗原，上述收集的rlp-pla2-ab为第一抗体，使用hrp标记的abcam公司山羊抗鼠igg为第二抗体做wb，在47kd处有阳性条带产生，表明单链抗体rlp-pla2-ab制备成功(如图1泳道3所示)。
实施例8
本实施例的一种上述实施例中基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
一、抗人lp-pla2重组单链抗体的制备
见实施例7；
二、重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒的制备
见实施例4-6；
三、配制试剂r1
按照试剂r1的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
四、配制试剂r2
按照试剂r2的组分含量，将制得的重组抗人lp-pla2单链抗体胶乳颗粒以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。
实施例9
本实施例的一种上述实施例中基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒的使用方法。
一、制备校准品
校准品稀释液包括的成分及相应含量为：nah2po42.86g/l，na2hpo428.65g/l，nacl9.00g/l，bsa50.00g/l，蔗糖10.00g/l，nan31.00g/l，溶剂为纯化水。按照需要的lp-pla2，参考校准品浓度将相应的重组lp-pla2纯品(即，实施例7的步骤(7)得到的rlp-pla2)1.0mg加入1ml校准品稀释液中，制备得到1000ng/ml浓度的lp-pla2校准品；在使用的时候再用校准品稀释液按照比例稀释成多个浓度。本实施例中，校准品浓度选择0ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。
二、lp-pla2测定方法(日立7060全自动生化分析仪)
测定波长：主波长340nm，副波长700nm；
试剂比例：r1∶r2∶s＝240μl∶80μl∶10μl；
校准方式：spline；
读点方式：将试剂r1与样品加入，反应5min，读点a1；然后加入试剂r2后，反应5min，再读点a2；计算吸光度的变化。
其中，校准曲线见图2。
实施例10
本实施例用以评估上述实施例中基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒的性能。
1.灵敏度测定
用本发明所述的试剂盒对空白样本(含有5％牛血清的生理盐水)重复测定20次，最低检测限度为空白的均值浓度加上2个标准差，得到最低检测限度为4.51ng/ml，具体见表1。
表1本发明试剂盒的重复测定结果表
2.线性范围
线性相关系数：在[0ng/ml-800.0ng/ml]范围内用生理盐水稀释接近线性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)。测定与计算结果如表2所示，以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应满足线性相关系数r≥0.9900。
表2本发明试剂盒的线性评价结果表
图3是本发明试剂盒的拟合曲线图，如图3所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝1.0284x-3.7395，r2＝0.999，r2>0.99，满足临床要求。
3.与酶联免疫方法试剂盒测定结果的相关性
通过测定60例标本(其中，阳性血清30例，阴性血清30例)验证本发明试剂盒与酶联免疫方法试剂盒的相关性，检测结果如表3所示。将检测结果绘制成曲线图，如图4所示。由图4可知，本发明试剂盒与酶联免疫方法试剂盒的相关系数r2＝0.955，相关方程为：y＝1.1881x+0.6625。
表3本发明试剂盒与酶联免疫方法试剂盒的检测结果对比表
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>安徽大千生物工程有限公司
<120>一种基于重组单链抗体的lp-pla2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法
<130>2020
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
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