用于检测新型冠状病毒抗体的碱性磷酸酶蛋白芯片试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及病毒感染诊断技术，特别涉及检测新型冠状病毒抗体的蛋白芯片试剂盒及其制备方法。

背景技术：

冠状病毒与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。其病毒颗粒的直径60-200nm，呈球形或椭圆形，具有多形性，病毒有包膜，包膜上存在棘突，刺突糖蛋白是受体结合位点和主要抗原位点。

血清学检测疑似患者体内的病毒抗体情况，能够更准确、快速，低成本地排除其他病原体导致的发热患者，极大程度提高临床诊断和筛查效率，同时可以弥补核酸检测对技术要求高且假阴性比例较高的缺陷。

技术实现要素：

基于上述领域的需求，本发明提供一种碱性磷酸酶新型冠状病毒igm/igg抗体检测试剂盒，能够快速、低成本、微量血清(7微升)检测新型冠状病毒抗体。可以在60分钟以内出具检测结果，一次性10人份检测，每人平均用时6分钟。既可手工操作也可上机操作。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测新型冠状病毒抗体的蛋白芯片试剂盒，其特征在于，具有至少一块蛋白芯片

每块所述蛋白芯片具有至少一个亚检测区，每个亚检测区用于检测一份标本；

每个亚检测区内设置有以下几种检测斑：

由bsa附着形成的第一种检测斑

由新型冠状病毒抗原附着形成的第二种检测斑，

由人igg多克隆抗体或igm多克隆抗体附着形成的第三种检测斑，

检测斑之间相互分离；

所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白或新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白，或它们的混合物；

并且当蛋白芯片上具有由igg多克隆抗体附着形成所述第三检测斑时，还包括碱性磷酸酶标记的抗人igg多克隆抗体；当蛋白芯片上具有由igm多克隆抗体附着形成所述第三检测斑时，还包括碱性磷酸酶标记的抗人igm多克隆抗体。

所述第二种检测斑是由浓度为0.1-1mg/ml新型冠状病毒抗原附着形成；

所述第三种检测斑是由浓度为0.05-0.2mg/ml的人igg多克隆抗体或igm多克隆抗体附着形成。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，所述新型冠状病毒抗原是所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白和新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白以1～3：1质量比的混合物,优选为1:1质量比的混合物。显著提高了检测灵敏度和准确率。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，至少一块所述蛋白芯片上，包含两种亚检测区，其中一种亚检测区具有由人igg多克隆抗体附着形成的所述第三种检测斑；另一种亚检测区具有由igm多克隆抗体附着形成的所述第三种检测斑。根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，包括两种所述蛋白芯片，其中一种蛋白芯片上的第三种检测斑由人igg多克隆抗体附着形成；另一种蛋白芯片的所述第三种检测斑由igm多克隆抗体附着形成。

在上述两种方案中的试剂盒，可以对疑似患者的血清同时检测igg抗体和igm抗体，提高检测准确的。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，在每个所述亚检测区内，每种检测斑包含3-6个重复,每种检测斑排成一列，三种检测斑排成矩形阵列。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，每一个所述亚检测区的尺寸为长5～10mm，宽5～10mm，检测斑的尺寸为长0.5～1mm，宽0.5～1mm。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，所述检测斑之间的间隔距离为0.2～1mm。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，还包含碱性磷酸酶标记的抗人igg多克隆抗体，用于与具有人igg多克隆抗体附着形成所述第三检测斑的亚检测区配合使用,即用于在所述亚检测区内的检测斑上滴加待测血清后，滴加到并覆盖所述检测斑；

还包含碱性磷酸酶标记抗人igm多克隆抗体，用于与具有人igm多克隆抗体附着形成所述第三检测斑的亚检测区配合使用,即用于在所述亚检测区内的检测斑上滴加待测血清后，滴加到并覆盖所述检测斑。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，还包含0.05％的pbs-tween溶液和碱性磷酸酶显色底物液。

上述任一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述蛋白芯片的制备包括以下步骤：

获得经分区设置出所述亚检测区的芯片基片；

按照预设图案及尺寸将bsa、新型冠状病毒抗原、人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体点样固定在所述亚检测区内形成所述第一种、第二种和第三种检测斑；

所述新型冠状病毒抗原是所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白或新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白，或它们的混合物。

根据一种优选的制备方法，按照预设图案及尺寸将10％bsa、0.1-1mg/ml新型冠状病毒抗原，0.05-0.2mg/ml人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体点样固定在所述亚检测区内形成所述第一种、第二种、第三种检测斑。

根据一种优选的制备方法，优选0.5mg/ml新型冠状病毒抗原，0.1mg/ml人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体、10％bsa。

根据一种优选的制备方法，每个亚检测区域内的所有检测斑采用了相同体积的获试，且在1-30nl之间。

根据一种优选的制备方法，所述检测斑通过多次非接触式微量点样形成，优选通过3-10次非接触式微量点形成，每次点样300-600pl。

本发明提供了一种简单易行、经济快速，又切实可靠的蛋白芯片方法，检测新型冠状病毒肺炎血清中的igm/igg抗体，本发明仅需要微量血清(7ul),一次可检测多人份，在60分钟以内出具检测结果，可定性检测人血清或血浆中的新型冠状病毒igm/igg抗体，检测结果准确，灵敏度高。

本发明的蛋白质芯片试剂盒的优势：

一、本发明对新冠状病毒抗原进行了选择，选出适合制成微量蛋白芯片的抗原片段以及抗原组合方案，临床检测数据显示能够灵敏准确地检出阳性血清。

二、允许同时检测多个样品。对同一样品重复多次，或者不同时间点取的样品以获得动态值，或者来自不同患者的样品同时检测；总之，实现高通量检测。整体上降低检测成本和提高检测效率。

三、本发明的蛋白芯片需要的血样及抗体量都大为减少，需检测血清量7.5ul,蛋白芯片上用于捕获抗体的检测斑，每个检测斑仅需蛋白液体1-30纳升,远远低于其他同类方法，大大降低了检测费用。

四、该发明利用碱性磷酸酶显色液进行显色判断实验结果，不需要扫描仪器，简单可视化，对人员技术要求不高，适合大面积使用。

附图说明

图1.本发明试剂盒中蛋白芯片平面示意图；

图2.本发明试剂盒中蛋白芯片中单个亚检测区中三种检测斑的截面示意图；

图3.本发明试剂盒中蛋白芯片中单个亚检测区示意图；

图4.本发明试剂盒中蛋白芯片样品示意图；

图5.本发明试剂盒的检测原理示意图；

图6.本发明试剂盒中蛋白芯片检测健康人血清结果图；

图7.本发明试剂盒中蛋白芯片检测临床确诊血清的结果图；

其中1-第一种检测斑；2-第二种检测斑；3-第三种检测斑，4-亚检测区。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

一种用于检测新型冠状病毒抗体的蛋白芯片试剂盒，其特征在于，具有至少一块蛋白芯片，如图1所示，每块所述蛋白芯片具有至少一个亚检测区4，每个亚检测区4用于检测一份标本；每个亚检测区4内设置有以下几种检测斑：由bsa附着形成的第一种检测斑1，由新型冠状病毒抗原附着形成的第二种检测斑2，由人igg多克隆抗体或igm多克隆抗体附着形成的第三种检测斑3，检测斑之间相互分离，如图2，3所示；所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白或新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白，或它们的混合物；

并且当蛋白芯片上具有由igg多克隆抗体附着形成所述第三检测斑时，还包括碱性磷酸酶标记的抗人igg多克隆抗体；当蛋白芯片上具有由igm多克隆抗体附着形成所述第三检测斑时，还包括碱性磷酸酶标记的抗人igm多克隆抗体。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，第二种检测斑2上的所述新型冠状病毒抗原是所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白和新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白以1～3：1质量比的混合物,优选为1:1质量比的混合物。实验数据发现，这类芯片方案比单一抗原方案显著提高了检测灵敏度和准确率。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，至少一块所述蛋白芯片上，包含两种亚检测区，其中一种亚检测区具有由人igg多克隆抗体附着形成的所述第三种检测斑；另一种亚检测区具有由igm多克隆抗体附着形成的所述第三种检测斑。这种方案中，以图1所示的芯片为例，一部分亚检测区4中的第二检测斑是由人igg多克隆抗体附着形成；一部分亚检测区4中的的第二检测斑是由人igm多克隆抗体附着形成。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，包括两种所述蛋白芯片，其中一种蛋白芯片上的第三种检测斑3由人igg多克隆抗体附着形成；另一种蛋白芯片的所述第三种检测斑3由igm多克隆抗体附着形成。

在上述两种方案中的试剂盒，可以对疑似患者的血清检测igg抗体和igm抗体，提高检测准确性的。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，在每个所述亚检测区内，每种检测斑包含3-6个重复,每种检测斑排成一列，三种检测斑排成矩形阵列。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，每一个所述亚检测区的尺寸为长5～10mm，宽5～10mm，检测斑的尺寸为长0.5～1mm，宽0.5～1mm。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，所述检测斑之间的间隔距离为0.2～1mm。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，还包含碱性磷酸酶标记的抗人igg多克隆抗体，用于与具有人igg多克隆抗体附着形成所述第三检测斑的亚检测区配合使用,即用于在所述亚检测区内的检测斑上滴加待测血清后，滴加到并覆盖所述检测斑；

还包含碱性磷酸酶标记抗人igm多克隆抗体，用于与具有人igm多克隆抗体附着形成所述第三检测斑的亚检测区配合使用,即用于在所述亚检测区内的检测斑上滴加待测血清后，滴加到并覆盖所述检测斑。

根据一种优选的实施方案，所述试剂盒中，还包含0.05％的pbs-tween溶液和碱性磷酸酶显色底物液。

本发明还提供上述任一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述蛋白芯片的制备包括以下步骤：

获得经分区设置出所述亚检测区的芯片基片；

按照预设图案及尺寸将bsa、新型冠状病毒抗原、人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体点样固定在所述亚检测区内形成所述第一种、第二种和第三种检测斑；

所述新型冠状病毒抗原是所述新型冠状病毒抗原是新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白或新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白，或它们的混合物。

根据一种优选的制备方法，按照预设图案及尺寸将10％bsa、0.1-1mg/ml新型冠状病毒抗原，0.05-0.2mg/ml人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体点样固定在所述亚检测区内形成所述第一种、第二种、第三种检测斑。

根据一种优选的制备方法，优选0.5mg/ml新型冠状病毒抗原，0.1mg/ml人igg多克隆抗体或人igm多克隆抗体、10％bsa。

根据一种优选的制备方法，每个亚检测区域内的所有检测斑采用了相同体积的获试，且在1-30nl之间。

根据一种优选的制备方法，所述检测斑通过多次非接触式微量点样形成，优选通过3-10次非接触式微量点形成，每次点样300-600pl。

示例1蛋白质芯片制备

所用试剂：

10％bsa

抗原1:新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基的受体结合域蛋白：产品名称：2019-ncovspikeprotein(rbd,fctag)，包含457氨基酸，分子量51.5kda，购自北京义翘神州科技有限公司，货号40592-v05h。

抗原2:新型冠状病毒棘突蛋白s1亚基蛋白:产品名称：sars-cov-2(2019-ncov)spikeprotein(s1subunit,histag)，包含681氨基酸，分子量76.5kda，购自北京义翘神州科技有限公司，货号40591-v08b1。

浓度为0.1mg/ml的人igg，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

浓度为0.1mg/ml的人igm，r&dsystems,inc.

碱性磷酸酶标记的抗人igg，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

碱性磷酸酶标记的抗人igm，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

pbs配方:氯化钠(nacl)8g，氯化钾(kcl)0.2g，磷酸氢二钠(na2hpo4)1.44g，磷酸二氢钾(kh2po4)0.24g，调ph7.4,定容1l

pbst配方：1lpbs,+1mltween-20；

芯片基片为醛基芯片，购自上海百傲公司，每张芯片包含10个检测方格，每个方格检测一份血清，一次检测10份血清。

表1.芯片制作方案

每种检测斑试剂点成1列，每列四个重复的检测斑，如图1。

其中点样采用非接触式微量点样，每个检测斑的点样量为30nl，每次点样600pl，通过5次完成点样。

每个检测斑的点样体积相同。

示例2.检测方法的确定

本发明的蛋白芯片操作流程及原理，如图5所示，步骤如下：

1.制备好的芯片上，每个亚检测区4内加入一份患者血清(7ul)，室温存放15分钟，使血清中的新型冠状病毒抗体与芯片上的新型冠状病毒抗原结合；

2.采用0.05％的pbs-tween洗涤芯片，每次5s，洗涤5次，清洗非特异结合；

3.当第二检测斑为人igg多克隆抗体附着形成，加入碱性磷酸酶标记的抗人igg；当第二检测斑为人igm多克隆抗体附着形成，加入碱性磷酸酶标记的抗人igm；室温存放1525分钟，在芯片上形成新型冠状病毒抗原-新型冠状病毒抗体-碱性磷酸酶标记的抗人igg(或新型冠状病毒抗原-新型冠状病毒抗体-碱性磷酸酶标记的抗人igm复合体)，和人igg-碱性磷酸酶标记的抗人igg复合体(或人igm-碱性磷酸酶标记的抗人igm复合体)，0.05％的pbs-tween洗涤芯片，每次5s，洗涤5次，清洗非特异结合；

4.加入碱性磷酸酶显色底物nbt/bcip。

预期结果：对于阳性血清，第一检测斑不显色，第二检测斑显示紫蓝色，第三检测斑显紫蓝色。如图6所示，检测孔1-10均是正常人血清检测结果，属于阴性结果，bsa检测斑和新型冠状病毒抗原检测斑没有显色，人igg/igm检测斑显示紫蓝色。

实验例，采用方案3的芯片检测新冠状病毒临床血清，步骤采用示例2所确定的方法：

临床血清来自浙江医院收治的9名新型冠状病毒肺炎患者的血清。

结果如图7所示，检测孔10为健康血清，人igg/igm检测斑显示紫蓝色，为阴性结果；

检测孔第1-9为新型冠状病毒肺炎患者血清，结果显示两排紫蓝色检测斑，即新型冠状病毒抗原检测斑和人igg/igm检测斑显示紫蓝色，为阳性结果。

其它方案的芯片检测得到相同的定性结果。