一种胶体金试纸及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医用检测器械领域，特别是涉及一种胶体金试纸及其制备方法和应用。

背景技术：

2020年2月11日，国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses，ictv)宣布新型冠状病毒的正式名称：严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，2019-ncov)。当日，世界卫生组织(who)总干事谭德赛宣布，新型冠状病毒感染的肺炎将正式被命名为“covid-19”。

目前对新冠病毒仍然没有特效药和疫苗，最有效的方法是隔离和监测。而新冠病毒目前临床上以核酸检测为金标准，然而，由于采样部位和操作手法的差异，常常出现漏检的情况发生，临床上亟需有其他有效的检测方法作为辅助检测方法。此外，对一些流动人群聚集地，使用核酸检测这种需要依赖大型机器的方法并不现实。对患者血清中针对新冠病毒抗原的igm和igg检测是一种可靠的方法。而使用胶体金标法则因为其简便快速，不需要机器，适合大规模筛查，是检测新冠病毒诱导产生的igm和igg的有力工具。目前，国内的新冠病毒胶体金仍然没有成熟的产品上市，前期的产品也出现了假阳性过高的情况，其原因之一是抗原的选择方面有差异，因为人们容易认为使用全长抗原更加精准，却忽视了全长抗原容易产生交叉反应。

2019-ncov具有棘突蛋白s,基质蛋白m,包膜蛋白e和核蛋白n等数种结构蛋白。目前常用于做检测试剂的是s抗原，然而，业内反映使用全长的s抗原容易产生假阳性。因此，筛选更合适的抗原制备胶体金检测卡，是目前胶体金检测卡需要解决的重要问题。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种胶体金试纸的制备方法，针对新型冠状病毒的特异性片段，得到s蛋白的rbd片段，有利于降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。

一种胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：

制备抗原：采用293t细胞表达2019-ncov的s蛋白上的rbd抗原片段，分离纯化，得到重组rbd抗原，所述重组抗原rbd氨基酸序列如seqidno.1所示；

制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，在封闭液中浸泡，烘干，取出备用；

制备金标抗体：配制氯金酸溶液，加热，加入柠檬酸三钠溶液，继续加热至液体呈亮红色，停止加热，得到胶体金，调节胶体金ph至7.3-7.8，加入2019-ncov抗体，混匀，离心，弃掉上清液，清洗沉淀，用金标抗体保存液溶解，备用；

冻干：将金标抗体铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到冻干金标抗体玻璃纤维膜；

制备试纸板：裁切金标抗体玻璃纤维膜，将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，即得胶体金试纸。

seqidno.1：

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上述制备方法，针对2019-ncov新型冠状病毒的特异性片段，选取的片段是新冠病毒s蛋白的“受体结合结构域”蛋白(rbd)，即s蛋白与ace2相联结的地方，是决定新冠病毒感染能力的重要片段，研究结果表明新冠病毒s蛋白以三聚体形态存在，每一个单体中约有1300多个氨基酸，其中300多个氨基酸构成了“受体结合结构域”(rbd)，空间结构也是决定抗原特异性的重要指标，基于此，本发明得到得到s蛋白的rbd片段，作为抗原的诊断试剂，用该重组抗原制备得到的胶体金试纸，可以降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。

在其中一个实施例中，所述制备抗原步骤具体为：筛选2019-ncov的s抗原的rbd片段基因，将rbd片段基因与载体连接，导入293t细胞中，培养293t细胞，表达重组抗原rbd，收集培养上清液，分离纯化，获得重组抗原rbd。

可以理解地，s蛋白的rbd片段核苷酸序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了目标序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，即将其克隆入载体，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

在其中一个实施例中，所述载体选用质粒或病毒颗粒。可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列，然后可将该dna序列引入已知的载体和细胞中。表达载体中的多核苷酸序列可以可操作地和表达控制序列连接，还包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择性标记。

载体可以通过转化、转导、转染等方式进入宿主细胞。宿主细胞经过本领域所熟知的方法培养一段时间，用常规方法如物理或化学方法收集上清并纯化抗原蛋白。

本发明还提供一种由上述方法制备得到的胶体金试纸。该试纸可以高效、快速、准确地检测2019-ncov。

本发明还提供一种新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，包括：

底座，设有安装槽，所述安装槽的长度方向沿所述底座的长度方向延伸；

盖体，覆盖在所述底座上，所述盖体包括透明的观察窗、加样孔和加样盖，所述加样盖连接于所述盖体，用于嵌入所述加样孔内以封闭所述加样孔；

上述胶体金试纸，设于所述安装槽内并且所述观察窗的下方，所述胶体金试纸的检测区位于所述加样孔的下方，在血清经所述加样孔滴入所述检测区后，通过所述观察窗观察所述胶体金试纸的检测结果。

上述新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，一方面采用上述胶体金试纸，有利于提高检测效率和准确性，另一方面，将胶体金试纸设置在盖体内处于密闭状态下，在测试时通过加样孔滴入血清，使得血清能够在密闭的环境下被检测，通过观察窗来观察检测结果，从而可以降低气溶胶传播能力，降低新冠病毒在检测时的传染风险。

在其中一个实施例中，所述底座还包括若干卡座，所述卡座设于所述安装槽附近，用于卡持所述胶体金试纸。

在其中一个实施例中，所述底座还包括导向部，设于所述安装槽的端部，用于引导所述胶体金试纸移动至所述安装槽内。

在其中一个实施例中，述盖体还包括与所述安装槽对应的档门，所述档门铰接于所述盖体，在所述胶体金试纸转动所述档门进入所述安装槽内后，所述档门回复至原位以密封所述盖体。

在其中一个实施例中，所述加样孔的横截面的面积沿远离所述胶体金试纸的方向递减。

在其中一个实施例中，所述加样孔的横截面的面积沿远离所述胶体金试纸的方向递减的圆锥形。

在其中一个实施例中，还包括一连接带，所述连接带的一端连接于所述加样盖，另外一端连接于所述盖体。

在其中一个实施例中，所述盖体为采用透明材料制作的盖体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的胶体金试纸的制备方法，通过基因克隆获得了rbd抗原基因，并在293t哺乳动物细胞内成功表达和纯化，用该重组抗原制备得到的胶体金试纸，可以降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。

本发明的胶体金试纸检测卡，一方面采用本发明的胶体金试纸，有利于提高检测效率和准确性，另一方面，将胶体金试纸设置在盖体内处于密闭状态下，在测试时通过加样孔滴入血清，使得血清能够在密闭的环境下被检测，通过观察窗来观察检测结果，从而可以降低气溶胶传播能力，降低新冠病毒在检测时的传染风险。

附图说明

图1是实施例中新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡的结构示意图；

图2是图1中a-a处的剖面结构示意图；

图3是实施例中底座和胶体金试纸的结构示意图；

图4是蛋白纯化测试结果；

图5是胶体金检测卡测试结果；

图6是实施例1和对比例1测试igm结果。

图中：

10-盖体；11-观察窗；12-加样孔；13-加样盖；131-连接带；14-档门；20-底座；21-安装槽；22-卡座；23-导向部。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种胶体金试纸，通过以下方法制备得到：

1)制备抗原：采用293t细胞表达2019-ncov基因重组抗原rbd，收集细胞上清液，分离纯化，得到重组抗原rbd，所述抗原rbd氨基酸序列如seqidno.1所示；

2)制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，室温晾干20min，在37℃封闭液中浸泡60min，37℃烘干2h，取出备用；该包被液为：0.05mph9.6硫酸盐缓冲液，用0.22μm膜滤过，4℃下保存，一周内使用；封闭工作液为：2％bsa、2％脱脂奶、0.01mph7.0pbs，0.22μm膜滤过，4℃下保存，一周内使用；

3)制备金标抗体：配制质量分数为0.01％的氯金酸溶液，加热，加入质量分数为1％柠檬酸三钠溶液，每100ml氯金酸溶液加入4ml柠檬酸三钠溶液，继续加热至液体呈亮红色，停止加热，得到胶体金，调节胶体金ph至7.5，加入10μg2019-ncov抗体，混匀，静置30min，13000rpm离心30min，弃掉上清液，用标记洗涤液洗涤沉淀两次，用金标抗体保存液溶解，4℃下保存，一周内使用；

4)冻干：将标记好的胶体金铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺6cm²，冷冻干燥，得到冻干金标抗体玻璃纤维膜，4℃下保存；

5)制备试纸板：将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，组成试纸板，将试纸板切成宽度2.5mm的胶体金试纸。

实施例2

一种新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，包括底座20、盖体10和实施例1的胶体金试纸。

盖体10覆盖在所述底座20上，优选采用透明材料制作。所述盖体10包括透明的观察窗11、加样孔12和加样盖，所述加样盖连接于所述盖体10，用于嵌入所述加样孔12内以封闭所述加样孔12。所述盖体10还包括与所述安装槽21对应的档门14，所述档门14的顶部铰接于所述盖体10，在所述胶体金试纸转动所述档门14进入所述安装槽21内后，所述档门14回复至原位以密封所述盖体10。所述加样孔12的横截面的面积沿远离所述胶体金试纸的方向递减，优选地，所述加样孔12的横截面的面积沿远离所述胶体金试纸的方向递减的圆锥形。加样盖可以扣合在加样孔12内，用于堵塞该加样孔12。本实施方式中，加样盖通过一连接带131连接于盖体10，所述连接带131的一端连接于所述加样盖，另外一端连接于所述盖体10。

图3是底座20和胶体金试纸的结构示意图，如图3所示，底座20设有安装槽21，所述安装槽21的长度方向沿所述底座20的长度方向延伸。所述底座20还包括若干卡座22，所述卡座22设于所述安装槽21附近，用于卡持所述胶体金试纸。所述底座20还包括导向部23，设于所述安装槽21的端部，用于引导所述胶体金试纸移动至所述安装槽21内。

胶体金试纸设于所述安装槽21内并且所述观察窗11的下方，所述胶体金试纸的检测区位于所述加样孔12的下方。由于病原体2019-ncov为一种新型的冠状病毒,具有棘突蛋白s(spike),基质蛋白m(matrix),包膜蛋白e(envelope)和核蛋白n(nuclearprotein)等数种结构蛋白。冠状病毒s蛋白参与病毒与细胞受体结合、介导病毒与宿主膜融合。同时，s蛋白主要负责诱导宿主免疫反应和病毒中和抗体。s蛋白还决定病毒组织嗜性。s蛋白全称为刺突糖蛋白(spikeglycoprotein)，位于新冠病毒最外层，像一个个突起的“皇冠”。冠状病毒m蛋白位于病毒粒子内部和外部，是病毒包膜重要组成成分要组成成分和病毒释放关键蛋白。冠状病毒核衣壳蛋白(n蛋白)有一个结构性作用，并参与rna合成。e蛋白具有离子通道活性，在发挥离子通道作用时，是形成五聚体高级结构而发挥作用，冠状病毒e和m控制着病毒粒子组装，研究证实e蛋白缺失突变株丧失致病力。因此，该胶体金试纸采用基因工程表达的rbd片段进行包被，分别检测血清中新冠病毒igm和igg。对于分别新冠病毒igm和igg采用不同胶体金试纸进行检测，可避免检测igm和igg时的干扰。在血清经所述加样孔12滴入所述检测区后，通过所述观察窗11观察所述胶体金试纸的检测结果。

使用时，将胶体金试纸靠近档门14并推动档门14转动，在导向部23的导引下伸入安装槽21内。

在胶体金试纸完全进入安装槽21之后，档门14在重力作用下复位处于关闭状态，从而使得胶体金试纸处于密封状态。

打开加样盖，通过加样孔12向胶体金试纸滴入血清进行新型冠状病毒的测试，完成加样后盖上加样盖，最后通过观察窗11观察胶体金试纸的测试结果。

该新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡将胶体金试纸设置在盖体10内处于密闭状态下，在测试时通过加样孔12滴入血清，使得血清能够在密闭的环境下被检测，通过观察窗11来观察检测结果，从而可以降低气溶胶传播能力，降低新冠病毒在检测时的传染风险。

对比例1

一种胶体金试纸，与实施例1基本相同，区别在于，制备抗原膜时包被的是重组s全长抗原。

实验例1

2019-ncov的rbd蛋白纯化和确认

将实施例1所得的蛋白分别采用sds-page和免疫印迹法进行测试，纯化蛋白的sds-page分析如图4(a)所示，纯化蛋白的免疫印迹如图4(b)所示，说明本实施例1的方法能够获得高纯度的rbd蛋白。

实验例2

测试胶体金检测卡

采用阳性标本初步验证本发明的有效性，测试实施例2胶体金试纸检测卡的质量。测试结果如图5所示，左图为阴性对照，右图为阳性标本，结果说明本发明的胶体金试纸卡能有效检测阳性标本。

实验例3

采用实施例2胶体金试纸检测卡检测96例新冠可疑患者的血清样本，免疫荧光检验(ifa)的方法作为对照，测试结果如下表所示：

表1新冠可疑患者血清样本新冠病毒抗体检测结果

上表可知，实施例2胶体金试纸检测卡的特异性为92.9％(79/85)，敏感性为90％(10/11)。

实验例4

使用elisa法测试实施例1(包被重组rbd抗原)和对比例1(包被重组s全长抗原)胶体金试纸的特异性，分别检测相同的12例病人血清，每个病例做两个复孔。结果如图6和下表所示。

表2elisa测试结果

注：两个复孔数值均＜0.3为阴性，两个复孔数值均≥0.3为阳性。

从上表可以看出，实施例1的阴性读数较低，阳性值读数很高，阴性和阳性差别较大，而对比例1的阴性和阳性差别较小。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广东药科大学附属第一医院

<120>一种胶体金试纸及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>457

<212>prt

<213>冠状病毒蛋白rbd片段(coronavirus)

<400>1

argvalglnprothrgluserilevalargpheproasnilethrasn

151015

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202530

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