一种用斑马鱼评价食用油安全性的方法与流程

1.本发明涉及食用油安全性评价的技术领域，具体涉及一种用斑马鱼评价食用油安全性的 方法。


背景技术：

2.食用油脂是居民使用最普遍的调味品，同时又是加热原料的介质，兼具调味和传热的作 用。食用油作为人体所需的重要营养物质之一，是我们日常生活不可缺少的必须品，对人体 的健康发挥着重要的作用。但是，目前存在的质量安全问题，引起了广大消费者的强烈愤怒 和国家的高度重视。食用油的质量与安全问题，主要来自油料作物的种植、收割、储藏、加 工和使用各个环节，具体为：
[0003][0004]
(1)油料作物在种植、收割、储藏过程中带入的黄曲霉毒素(花生油等)，硫苷、恶唑 烷硫酮(菜籽油)，棉酚(棉籽油)，苯并芘(椰子油)等天然毒素；另外，一些脂肪酸，如 菜籽油中的芥酸、棉籽油中的环丙烷酸也是食用油面临的安全问题。
[0005]
(2)转基因食用油，如转基因大豆油。
[0006]
(3)杀虫剂和多氯联苯超标。
[0007]
(4)重金属污染。在种植过程中，土壤水体中重金属会在油料作物体内累积，并进入食 用油中；加工过程中生产设备中的重金属也会迁移进入食用油。
[0008]
(5)加工带来的苯并芘、反式脂肪酸以及浸出毛油中的溶剂超标问题。
[0009]
(6)高温煎炸过程中形成的杂环化合物、热氧化聚合物等有毒有害物质。例如，土豆片 在高温油炸下会形成丙烯酰胺。
[0010]
(7)油脂储藏过程中油脂出现氧化、酸败，导致酸价和过氧化值升高。
[0011]
(8)非法添加或掺假问题。非法添加是近年来导致食品安全事件的主要原因，食用油中 同样存在非法添加问题，如过量添加等抗氧化剂、煎炸过程使用的硅酮(消泡剂)、羟基硬脂 酸甘油三酯(结晶抑制剂)；非法添加非食用香精、色素以及工业用油等违禁添加物。
[0012]
(9)餐厨废弃油脂。主要是指人们在日常生活中存在的各种各类质量低劣的问题油，比 如，多次使用过的煎炸油，通过回收的一些问题食用油等，人们如果经常食用这些质量低劣 的问题油，就会引发各种疾病，甚至导致癌症。
[0013]
根据《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验部分》，目前食品安全检测的项目主要 分为三大类：一类是药残留(包括农药、兽药、饲料添加剂、食品添加剂等在内)，一类是重 金属，另外一类是致病性寄生虫、微生物、生物毒素。
[0014]
目前基于食用油安全性检测的技术，大多针对生物毒素、重金属和其他污染物残留等指 标，运用化学分析手段进行检测分析，鲜见运用生物学手段进行检测分析的，这就造成了存 在如下技术不足之处：
[0015]
1)由于历史原因，现有国家标准中的检测指标多数借鉴国外标准制定的，但化学
品的毒 性是否会因人种差异呈现出毒性差异，目前尚无大量的样本数据验证支持，这意味着，在白 种人标准剂量下无害的化学品，是否对中国人也无害，存在不确定性。
[0016]
2)无法检测不同化学物质对人体的协同毒性。不同化学品由于理化性质不知，相互作用 时能否产生协同增效，抑或协同减效，存在不确定性；导致判断待测样品检测协同毒性的难 度更大于单一有毒物质的毒性。
[0017]
3)无法检测不明添加物，只能检测已知的化学物质。倘若有已知化学物质的类似物、衍 生物及其在人体内的代谢产物等作为不明添加物，则很难检测。
[0018]
4)有毒物质种类繁多，从时间、人力、物力等成本因素考虑，无法面面俱到，做到全检。
[0019]
斑马鱼与人类基因同源性高达85％，由于基因组与蛋白质组与人类具有很高的相似性， 因此疾病的发病机制和信号传导通路等方面与人类基本近似，且生物结构和生理功能与哺乳 动物高度相似。与其他实验动物相比，斑马鱼还具有胚胎及幼鱼身体透明(可在体直接用肉 眼和解剖显微镜观察各器官的发育过程)、体积小(可用微孔板分析)、发育周期短、体外受 精、繁殖能力强、单次产卵数较高等特点(zon li,peterson rt.in vivo drug discovery in thezebrafish[j].drug discovery,2005,4:35-44.)。模式生物斑马鱼近年来已成为研究人类疾病模型 之一，既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性 强、可比度高、可观察多个器官等优点，在化合物安全性评价中得到广泛应用(barros t p, alderton w k,et al.zebrafish:an emerging technology for in vivo pharmacological assessment toidentify potential safety liabilities in early drug discovery[j].british journal of pharmacology,2008, 154:1400-1413.)。
[0020]
因此，申请人考虑采用斑马鱼模型，进行整体生物学评价，通过观察斑马鱼的体内状态， 来判断食用油的安全性，作为传统的化学检测手段的补充完善。
[0021]
经检索文献，发现目前斑马鱼模型进行安全性评价的，评价对象都是药品、化妆品，未 见应用于食用油领域的。而食用油中的成分杂、含量高低不同，食用油的安全性标准要求也 迥异于药品、化妆品，故如何开发出一种适用于食用油安全性的斑马鱼模型及其检测方法， 是本领域技术人员急需解决的技术难题。


技术实现要素：

[0022]
本发明要解决的技术问题在于，提供一种全新的用斑马鱼评价食用油安全性的方法，通 过对食用油进行酶解、化学抽提的前处理，得到检测品的提取物，再通过斑马鱼处理后得到 毒性评价数据，据此判断、评价食用油的安全性，解决了上述现有技术存在的不足。
[0023]
为此，本发明采取了以下技术方案：
[0024]
一种用斑马鱼评价食用油安全性的方法，构建斑马鱼毒性评价模型，通过提取、去脂、 洗涤的方式前处理食用油，得到检测品的提取物，再通过斑马鱼处理后得到毒性评价数据， 分析并评价食用油的安全性。
[0025]
优选的，一种用斑马鱼评价食用油安全性的方法，包括如下步骤：
[0026]
1)提取物的制备
[0027]
取体积比为3:1.5:1:1的食用油、乙腈、dmso和超纯水混合，震荡，提取有机溶剂和
水 相，弃去油脂相；再加入环己烷洗涤两次，提取液氮吹干干燥3h，用0.5ml 70％甲醇定容，
ꢀ-
20℃备存；
[0028]
2)安全性评价
[0029]
取步骤1)制得的提取物稀释至斑马鱼胚胎培养基，稀释浓度为1.67μl/ml、3.3μl/ml、 6.7μl/ml、13.3μl/ml、26.7μl/ml，得提取物稀释液；
[0030]
取4-128个细胞期的斑马鱼胚胎暴露于含有提取物稀释液的微孔板，设置斑马鱼胚胎培 养基、3.7mg/l二氯苯胺分别作为阴性对照组和阳性对照组；暴露48h后，观察斑马鱼胚胎 的毒性症状，计算斑马鱼胚胎的死亡率，判断并评价食用油的安全性。
[0031]
更优选的，步骤1)中乙腈与环己烷的体积比为1:2。
[0032]
更优选的，食用油选自大豆油、猪油、人造黄油、奶油中的一种。
[0033]
更优选的，步骤2)中斑马鱼胚胎培养基的成分及含量为：294.0mg/l的无水氯化钠、 123.3mg/l的七水合硫酸镁、63.0mg/l碳酸氢钠、5.5mg/l的氯化钾的去离子水。
[0034]
更优选的，步骤2)中的安全性评价采用weibull模型进行剂量-效应模拟，通过matlab 进行数学建模得到拟合曲线，拟合曲线上y＝0.1的点值代表noeal值，根据hbgv值来判 断食用油的安全性；hbgv值的计算公式如下：hbgv＝noael/ufs斑马鱼；
[0035]
其中，hbgv值代表健康指导值，ufs斑马鱼代表不确定系数值，其计算公式为：
[0036]
ufs斑马鱼＝ufs哺乳动物
÷
10
average(log lc50斑马鱼/log lc50哺乳动物)
。
[0037]
本发明中的提取，优选为有机及无机溶剂提取(如乙腈、dmso和水按比例混合的提取)。
[0038]
本发明中的数据分析包括利用weibull模型对样品毒性剂量反应进行模拟，计算noael， 进而进行健康指导值计算(hbgv)，从食品安全性角度提供每日最大摄入量。
[0039]
数学建模
[0040]
利用weibull模型对食用油安全性进行剂量-效应模拟，通过matlab进行数学建模得到 拟合曲线，weibull模型公式：
[0041]
食用油的安全性评价公式为：hbgv＝noael/ufs斑马鱼，其中，hbgv代表健康指导 值，noael代表无作用剂量值，ufs代表不确定系数值。
[0042]
1)noeal的计算：
[0043]
通过在拟合曲线上寻找y＝0.1的点值，符合oecd对斑马鱼正常死亡率的定义。
[0044]
2)ufs的计算：
[0045]
不确定系数一般使用默认系数来表明不确定性与变异性。以往从某个实验动物研究获得 的noael转换为人类暴露的健康指导值时，通常使用的不确定系数是100(见ipcs标准， 1987)。但存在数据缺陷，例如缺乏慢性疾病研究中，各个实验剂量均检测到效应却无法确定 noael值。亦因此，还可用loael来制定健康指导值(见ipcs标准，1994)。默认的100 倍不确定系数代表两个独立的10倍系数的乘积(即100＝10*10)，2个“10倍”的含义分别 为：
①
用于推导pod的实验动物的平均反应与一般人群反应之间的差异；
②
高敏感人群与一 般人群反应的变异性(ipcs，1987)。
[0046]
现有对健康指导值理解成100＝10*10的研究价值在于，明确了基于人群实验研究获得的 noael和基于传统模式动物(如鼠、犬等)实验获得的noael会使用不同的不确定系数， 为健康指导值的研究增加了灵活些。
[0047]
但是，推导pod的实验动物的平均反应与一般人群反应之间的差异倍数10倍，并不适 用于斑马鱼，因为pod实验动物毒性测试多为喂食或者注射，而斑马鱼的毒性测试则是利用 吸收的方式，两者的实验原理迥然不同。因此，申请人创造性地通过斑马鱼与哺乳动物化学 品毒性评价的lc50来进行转换，计算出适合斑马鱼模型的ufs，转换公式如下：
[0048]
ufs斑马鱼＝ufs哺乳动物
÷
10
average(log lc50斑马鱼/log lc50哺乳动物)
。
[0049]
经过计算，得出不同种类的食用油，其ufs斑马鱼的范围值为5～20。
[0050]
本发明提供的一种用斑马鱼评价食用油安全性的方法，与现有技术相比，有益效果如下：
[0051]
本发明通过选择适合的提取溶剂、洗涤溶剂，对食用油进行提取、去脂、洗涤的前处理 以及斑马鱼处理，得到毒性评价数据，并基于数学建模分析，来判断、评价食用油的安全性， 其检测准确度高，检测方法科学合理，造模周期短使得检测成本大大降低，为向广大民众、 企业、政府普及推广该检测方法提供了现实可行性。
附图说明
[0052]
图1为本发明应用例1的weibull模型对企业a大豆油安全性评价的拟合曲线。
具体实施方式
[0053]
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明中的附图，对本实 施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对 发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变， 都落入到了本发明的保护范围。
[0054]
实施例1前处理方法的考察
[0055]
本实施例对比化学抽提法、酶解法、酶解-化学抽提法，发现酶解法可以将脂类物质降解 为脂肪酸，对斑马鱼的生存环境影响很大，并且引入了脂肪酶等蛋白质类物质。另外，由于 食用油中脂类物质含量极高，酶解难度很大，成本很高。而酶解-化学抽提法与化学抽提法的 提取率无显著性差异，综上，故选择化学抽提法前处理食用油，既可以降低成本，还可以提 高时间效率。
[0056]
三种前处理方法的比较结果见表1：
[0057]
表1三种食用油前处理方法比较
[0058] 斑马鱼实验环境影响有害物质提取率成本、时间化学抽提法+++++酶解法++++++++酶解-化学抽提法++++++
[0059]
综合考虑提取物对斑马鱼实验环境的影响、有害物质提取率和成本时间等因素，斑马鱼 实验环境影响应为“+”以下，有害物质提取率应为“+++”以上，成本和时间应为“+”以 下。综上，确定采用化学抽提法前处理本发明的食用油。
[0060]
实施例2提取溶剂的考察
[0061]
对比10％-100％浓度的甲醇、乙腈、dmso、丙酮和四氢呋喃，及其两两混合物对食用油 脂的提取率，利用餐厨废弃油脂和自制已知残留的阳性样品进行提取率分析，阳性添加物主 要为溶剂残留、污染物、抗氧化剂和重金属盐类，对比结果发现乙腈：dmso：水为1.5：1： 1重复三次提取的提取率为最佳，各类物质提取率可达到70％-85％。提取液进行干燥处理， 干燥方法以55℃烘干和55
°
氮吹混合为主。干燥后最佳定容液为70％甲醇，考虑因素为有机 溶剂对斑马鱼的毒性和有机溶剂水溶液对提取物的溶解性。实验结果见表2。
[0062]
表2不同比例有机溶剂混合的提取率比较
[0063]
有机溶剂比例混合物提取率单一物提取率斑马鱼毒性甲醇+重金属盐提取率低+乙腈+重金属盐提取率低++dmso+重金属盐提取率低+丙酮+重金属盐提取率低++四氢呋喃++重金属盐提取率低+++甲醇：水＝1.5：1++
×
+乙腈：水＝1.5：1++
×
++dmso：水＝1.5：1++
×
+丙酮：水＝1.5：1++
×
++四氢呋喃：水＝1.5：1+++
×
+++甲醇：乙腈：水＝1.5：1：1+++
×
+甲醇：dmso：水＝1.5：1：1++++
×
+甲醇：丙酮：水＝1.5：1：1+++
×
++甲醇：四氢呋喃：水＝1.5：1：1+++++
×
++乙腈：dmso：水＝1.5：1：1+++++
×
+乙腈：丙酮：水＝1.5：1：1++++
×
+乙腈：四氢呋喃：水＝1.5：1：1+++++
×
+++dmso：丙酮：水＝1.5：1：1++++
×
+dmso：四氢呋喃：水＝1.5：1：1++++
×
++丙酮：四氢呋喃：水＝1.5：1：1++++
×
+++
[0064]
综合考虑有机溶剂对斑马鱼的毒性、有害物质提取率、有害物质单一提取率的影响，确 定提取溶剂选择：乙腈：dmso：水＝1.5：1：1。
[0065]
实施例3去脂时洗涤溶剂的考察
[0066]
去脂步骤会被应用到食用脂类样品，通过评价常见各类去脂有机溶剂，包括环己烷、正 己烷、乙酸乙酯等，发现环己烷与极性有机相的比例为1：2、重复洗涤两次的去脂效果最好。
[0067]
实施例4斑马鱼毒性评价试验
[0068]
(1)急毒效应
[0069]
选用4-128个细胞期斑马鱼作为试验活体，将胚胎鱼样品提取物进行接触，根据受试物 稳定性选择采用静态或半静态系统进行试验，判定指标为胚胎凝结、未能发育体节。缺少心 跳及尾部与卵黄囊不分离，这些终点作为判定斑马鱼死亡的标志，可在24h和48h记
录观察， 并用于计算样品提取物的半数致死浓度lc50值和noael值。24h和48h为筛选出的合适的 观察时间，考虑因素为斑马鱼实验的时效性和准确性。
[0070]
72h以后，斑马鱼生长环境对其影响开始增大，另外毒性效果和48h-72h期间，毒性效果 已经达到极致，所以考虑48h以后的结果对样品本身安全性的评价并不准确。记录其他一些 非死亡毒性效应，作为毒性判定指标，如心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性。
[0071]
(2)特定毒性效应
[0072]
表型特定毒性：对特定组织、器官或激素系统的效应，测试样品提取物对斑马鱼胚胎的 特定效应。包括心脏毒性、肝毒性、肌肉毒性、神经毒性、肾脏毒性、耳毒性、癫痫易感性、 内分泌干扰、肠道蠕动性、皮肤色素沉着改变、胰脏毒性、诱癌作用。
[0073]
肝毒性试验：斑马鱼一直作为药物诱导的肝毒性模型进行研究。斑马鱼在受精后的几天 后的透明性使得能够对包括肝脏的内部器官进行活体视觉观察。斑马鱼在48h受精后(hpf) 完成原发性肝脏形态发生。当暴露于肝毒物时，可在显微镜下观察肝脏形态学的变化。评估 肝毒性的终点如：肝脏变性、肝脏大小及形状的变化及卵黄囊吸收延迟。
[0074]
心脏毒性试验：斑马鱼心脏是由心室和心房组成，且发育迅速，受精后24小时观察心血 管及心跳，且在72小时前完成心血管循环、腔室形成和血液循环。评价心脏毒性指标有如： 心率、心律、心包水肿、出血、血流减慢、静脉窦淤血等。
[0075]
应用例1大豆油的安全性评价
[0076]
实验目的：取企业a、b、c生产的大豆油，进行斑马鱼急性毒性测试，评价安全性。
[0077]
实验方法：
[0078]
(1)提取物的制备
[0079]
取不同企业来源的15ml大豆油与7.5ml乙腈、5mldmso和5ml超纯水混合，充分震荡， 提取有机溶剂和水相，弃去油脂相；加入15ml环己烷，洗涤两次进行去脂；再将提取液在氮 气流下进行55℃干燥3h后，用0.5ml 70％甲醇定容，并存储于-20℃下直至测试。
[0080]
(2)安全性评价
[0081]
取步骤(1)制得的大豆油提取物，稀释至斑马鱼胚胎培养基(含有294.0mg/l的无水氯 化钠、123.3mg/l的七水合硫酸镁、63.0mg/l碳酸氢钠及5.5mg/l的氯化钾的去离子水)浓 度为1.67μl/ml、3.3μl/ml、6.7μl/ml、13.3μl/ml、26.7μl/ml。将4-128个细胞期的斑马鱼胚胎暴 露于含有提取物稀释液的六孔板，每个孔板放置30颗鱼卵。同时设置培养基和3.7mg/l二氯 苯胺作为阴性和阳性对照。在26℃下暴露48小时后，在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎的毒 性症状。计算每一浓度的死亡率作为急性毒性终点。测试结果见表3。
[0082]
表3不同来源的大豆油提取物的急性毒性
[0083][0084]
(3)数据分析
[0085]
利用weibull模型对企业a的数据进行模拟，通过对weibull模型模拟出的数据与实验值 进行的比较，发现模型拟合良好，进而计算出模型中四个参数值，分别为theta1＝
1.0031, theta2＝1.0135,theta3＝1.5198,theta4＝1.5455。绘出拟合的连贯曲线(见图1)。
[0086]
从拟合曲线中可知，大豆油的ufs为19.3，据此计算hbgv值为0.0048g/ml＝4.8g/kg， 按照人的体重为60kg计，得出安全食用企业a大豆油的健康指导值为289g/天。
[0087]
应用例2猪油的安全性评价
[0088]
实验目的：取企业a、b、c生产的猪油，进行斑马鱼急性毒性测试，评价安全性。
[0089]
实验方法：
[0090]
(1)提取物的制备
[0091]
取不同企业来源的15ml猪油与7.5ml乙腈、5mldmso和5ml超纯水混合，充分震荡， 提取有机溶剂和水相，弃去油脂相；加入15ml环己烷，洗涤两次进行去脂；再将提取液在氮 气流下进行55℃干燥3h后，用0.5ml 70％甲醇定容，并存储于-20℃下直至测试。
[0092]
(2)安全性评价
[0093]
取步骤(1)制得的猪油提取物，稀释至斑马鱼胚胎培养基(含有294.0mg/l的无水氯化 钠、123.3mg/l的七水合硫酸镁、63.0mg/l碳酸氢钠及5.5mg/l的氯化钾的去离子水)浓度 为1.67μl/ml、3.3μl/ml、6.7μl/ml、13.3μl/ml、26.7μl/ml。将4-128个细胞期的斑马鱼胚胎暴露 于含有提取物稀释液的六孔板，每个孔板放置30颗鱼卵。同时设置培养基和3.7mg/l二氯苯 胺作为阴性和阳性对照。在26℃下暴露48小时后，在立体显微镜下观察斑马鱼胚胎的毒性 症状。计算每一浓度的死亡率作为急性毒性终点。测试结果见表4。
[0094]
表4不同来源的猪油提取物的急性毒性
[0095]