一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞ctcs的检测鉴定方法。

背景技术：

技术的不断改进和发展，ctcs的研究已成为当前肿瘤学研究的热点：不仅有助于对肿瘤转移机制的了解，而且在临床上有助于发现早期微转移、评估预后、评价治疗效果和实现个体化药物治疗。

ctcs检测首先要把血液中的肿瘤细胞和血细胞分离开来，分离方法有两大类：一类是根据细胞的特异性生物标记来富集，采用这一技术路线的主要有cellsearch系统、免疫磁性细胞分选仪（macs）、adnatest癌细胞检测系统、莱尔系统等。另一类是根据ctcs和血细胞物理特性的不同进行分离富集，包括密度梯度离心法和膜滤过分离肿瘤细胞法（isolationbysizeofepithelialtumorcells，iset）。目前，已有至少53种以上基于上述理论方法的检测技术体系被报道，但没有一种方法能够将ctcs没有遗漏地检测出来。ctcs检测成为制约ctcs临床应用的瓶颈。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括pd1、pd-l1、er、pr、her-2、gpc-3、vegf、p53、vimentin、tki-egfr、ras、ck、alk-d5f3、cd20、alk/eml4、beta-catenin、e-cadherin、ep-cam、hpv、idh-1、psa、psma、vegf、gfap、细胞角蛋白、ae1/ae3、雌激素受体、孕激素受体、bca-225、ca125、cea、ema、ercc1、hpv、ki-67、p53、top2a等作为ctcs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种将多种检测技术手段相结合，科学合理、准确高效的的循环肿瘤细胞ctcs的检测鉴定方法。

本发明是通过以下技术手段来实现的：

一种循环肿瘤细胞ctcs的检测鉴定方法，采用物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证。

所述的物理方法捕获为：

a.采集癌症患者外周血，盛于血样容器中；

b.血样容器的下方连接一带有过滤膜的过滤器，将外周血经过滤器过滤；所述过滤膜上均匀布满直径为10-25微米的滤孔；

c．过滤完成后，进行瑞氏液染色，pbs缓冲液冲洗干净，取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞ctcs。

所述的形态方法识别为：将收集的循环肿瘤细胞ctcs，放置到电子显微镜下，统计循环肿瘤细胞ctcs的数量，测量循环肿瘤细胞ctcs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞ctcs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞ctcs相对比，判断其类别。

所述的免疫方法验证为：将收集的循环肿瘤细胞ctcs加入脱色液中浸泡4-6小时，脱去ctc染色液；室温孵育；滴加100μldab显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；弃掉dab显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；返蓝后的ctc采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10min，然后加入15ml试剂a，振荡均匀后过滤；加入试剂b，脱色30min，干燥，中性树脂封固；光学显微镜下镜检。

上述的检测方法的装置，所述的捕获用的装置有铁架台，铁架台的上方固定有血样容器，血样容器的下方连接有滤器，滤器内固定有滤膜；滤器的下方分别有输液器和废液缸；所述的滤膜均匀布满有向下凹的滤孔，所述的滤孔上孔直径为40-60微米，下孔直径为10-18微米，下凹的深度为10-20微米，上孔与下孔之间呈圆弧状。

本发明的有益效果是，通过物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证相结合，形成一套科学合理，准确高效的检测鉴定方法，具有简单易行、准确度高的特点。

申请人针对ctcs检测技术体系中关键步骤：富集和鉴定进行攻关，提出了：“物理方法捕获，形态方法识别，免疫方法验证”的解决方案，在截留率、鉴定及假阳性率三个方面取得了核心技术突破性进展，开发了相应的检测设备和配套试剂，开展了临床研究，产生了重要的经济和社会效益。

附图说明：

图1是本发明的物理方法捕获的结构示意图。

图2是本发明的过滤膜的俯视图结构示意图。

图3是本发明的过滤膜的剖面图结构示意图。

图4是截留肿瘤细胞示意图。

图5是胰腺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图。

图中1.铁架台2.血样容器3.滤器4.输液器5.废液缸。

具体实施方式

实施例1

本发明的过滤装置如图1所示，包括有铁架台1，铁架台1的上方固定有血样容器2，血样容器2的下方连接有滤器3，滤器3内固定有滤膜，滤器3的下方分别有输液器4和废液缸5。

如图2所示，所述的滤膜均匀布满有向下凹的滤孔，所述的滤孔上孔直径为50微米，下孔直径为12微米，下凹的深度为15微米，上孔与下孔之间呈圆弧状。由于本发明将滤膜制成下凹的滤孔，普通细胞可以通过下孔流出，由于循环肿瘤细胞不能通过下孔，因而保留在滤孔内。本发明由于将滤孔制成圆弧状的凹孔，可以最大限度地保留了循环肿瘤细胞原有的形态，避免了循环肿瘤细胞的变形，为下一步的形态识别提供了保障。

以胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞pd-l1为例：

获取循环肿瘤微栓的方法，具体采用以下步骤:分离获取癌症患者外周血5毫升，将外周血经过滤器过滤，过滤完成后，从过滤装置中取下滤器，打开并移走滤器上口，将瑞氏染色液加入到滤器中，a、b染液各染色2min，pbs缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞ctcs。

将收集的循环肿瘤细胞ctcs，放置在载玻片上，直接在显微镜下观察ctm形态特征。统计循环肿瘤细胞ctcs的数量，测量循环肿瘤细胞ctcs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞ctcs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞ctcs相对比，判断其类别。如图4所示，从图中可以看出，分离出长约30微米、宽约18微米的循环肿瘤微栓。

因血样是依靠重力自然滤过，并且采用圆弧形的滤孔，所以分离获得的循环肿瘤微栓形态及免疫特征均不受破坏。

免疫方法验证如下：

将分离的循环肿瘤细胞置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去ctc染色液；

滴加100μl0.1%tritonx-100，室温孵育15min，di水洗2min×3次；

滴加100μl0.3%h2o2，室温孵育10min，pbs洗2min×3次；（4）滴加100μl抗人pd-l1一抗，室温孵育2h或4℃过夜，pbs洗2min×3次；

滴加100μl山羊抗人igg/hrp，18～26℃温度下孵育20min，pbs洗2min×3次；

滴加100μldab显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；

显色完成后，弃掉dab显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；

盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；

将返蓝后的ctc采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10min，然后加入15ml试剂a，振荡均匀后过滤；加入试剂b，脱色30min，干燥，中性树脂封固；

光学显微镜下镜检。