一种鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法与流程

本发明涉及食品真实性检测技术领域，尤其涉及一种鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法。

背景技术：

随着社会经济的发展，人们的生活水平得到很大改善。消费者对肉制品的消费观念已从单纯的“数量需求”转换到“质量需求”上。羊肉凭借高蛋白、低脂肪、肉质鲜美的特点深受消费者欢迎，因此羊肉的需求量不断上升，然而一些不法商贩在利益的驱使下经常使用一些廉价肉冒充羊肉进行售卖，如鸭肉等，严重影响了消费者权益。目前针对羊肉掺假问题，研究者们已开发出许多技术，如核酸检测的pcr技术，酶联免疫技术，气味检测的电子鼻技术等。pcr技术往往需要针对不同物种进行引物的设计和基因扩增，且易出现假阴性结果；酶联免疫技术的开展需要找到高特异性和热稳定性抗原；电子鼻技术主要针对挥发性的风味物质进行检测，且传感器对化合物具有选择性。值得注意的是，以上技术对同一物种或同一组织的掺假鉴别存在一定的局限性。

羔羊肉因肉质细腻鲜美，因此较成年羊肉具有更高的价格。近年来，使用廉价成年羊肉冒充优质羔羊肉日益成为扰乱市场秩序的一大挑战。由于属于同一物种，传统于dna、核酸等生物检测技术失效，因此，急需开发一种准确鉴别此类羊肉掺假的鉴别方法，以维护市场公平，保护消费者权益。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有问题而提出的一种筛选用于鉴别羔羊肉和成年羊肉特征标志物的鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明包括以下步骤：

a.提取待测样品获取极性与非极性代谢物提取物，对所述提取物进行代谢组学数据采集；

b.对上述代谢组学进行化学计量学分析，并建立分析模型筛选差异标志物，所述化学计量学分析包括主成分分析和正交偏最小二乘分析，通过所述主成分分析判断两组样品是否存在差异，通过正交偏最小二乘分析确定所述待测样品的潜在的特征标志物；

c.利用筛选出的所述特征标志物对所述待测样品进行鉴别；

进一步地，所述检测数据包括所有代谢物的相对峰面积与保留时间。

具体地，对所述检测数据进行预处理，所述预处理包括基线校正，峰提取，峰校正，标椎化和归一化，获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间，变异系数将超过30％化合物剔除；缺失值超过50％的特征值剔除，其余的缺失值采用该特征值在所有样品中的最小值的一半进行填充。

进一步地，基于主成分分析的分析模型，将变量重要性大于1同时t检验显著性水平值小于0.05的代谢物确定为差异性生物标志物。

具体地，基于正交偏最小二乘分析的分析模型，以变量重要性(vip)>1,显著性水平(p)<0.05,差异倍数(fc)>2作为门槛值获取潜在特征标志物。

进一步地，在化学计量学分析中通过正、负离子模式羔羊肉和成年羊肉进行潜在的特征标志物获取。

具体地，正、负离子模式的喷雾电压分别为5500v和-4500v，去簇电压分别为80v和-80v。离子源温度500℃。雾化器压力(gs1)50psi，加热辅助气压力(gs2)50psi，碰撞能35±15v。数据采集范围为50-1500da。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明为区分羔羊肉和成年羊肉提供了一种可靠、快速的鉴别方法，该方法方便、灵敏、精确，通过分析模型筛选差异标志物能够实现对羊肉的快速判别。

附图说明

图1为本发明提出的一种鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法流程操作过程图；

图2为本发明提出的一种鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法的pca得分图；

图3为本发明提出的一种鉴别羔羊肉和成年羊肉的方法opls-da模型图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明提供了一种鉴别同一品种羔羊肉和成年羊肉的方法。对检测数据进行化学计量学分析，提取特征信息，并建立分析模型，确定羔羊肉和成年羊肉的差异代谢物，利用筛选出的特征标志物对羔羊肉和成年羊肉进行鉴别。

材料与方法

甲醇、乙腈、丁醇及二氯甲烷购自fisher公司；甲酸和乙酸钠购自dikma公司；实验用超纯水(18.2mω)由milli-q系统(milliporebillerica,ma)制备。

样品的制备与提取

高山美利奴细毛羊样品采自甘肃省肃南。4份成年羊肉样品(3岁，50.05±6.96kg)和4份羔羊肉样品(8个月，24.48±2.23kg)。所有样品均采自同一牧场，在放牧过程中可自由采食。每只羊取相同部位背最长肌，搅碎后放置于-80℃冰箱备用。

样品制备流程：称取100mg样品置于10ml离心管中，加入3ml二氯甲烷/甲醇(2/1,v/v)混合液，之后加入2.5ml超纯水，超声20min，10000转/min离心15min后去下层清夜转移至玻璃离心管中，氮吹至近干，用1ml甲醇复溶，过0.22μm滤膜后装瓶待测。质量控制样品(qc)的制备是将所有待测样品取相同体积液体混合。qc样品的作用是在仪器分析过程中监测仪器状态及数据的稳定性。

实验所用仪器为exionlc超高效液相色谱串联高分辨四级杆飞行时间质谱(sciex,redwoodcity,ca,usa)，配备的色谱柱为c18柱(2.1×150mm,2.7μm,agilent,usa)。液相条件：流动相a和b分别为水/乙腈(15/85,v/v)和丁醇，两相均含0.1％甲酸和5mm乙酸铵。流动相b洗脱梯度：0min,2％；3min,90％；5min,50％；6min,55％；9min60％；11min70％；13min,2％；13-15min,保持2％.进样量5μl,流速0.3ml/min，柱温40℃。质谱条件：离子源为电喷雾离子源(esi)，采集模式为数据关联采集模式(ida)，动态背景扣除。正、负离子模式的喷雾电压分别为5500v和-4500v，去簇电压分别为80v和-80v。离子源温度500℃。雾化器压力(gs1)50psi，加热辅助气压力(gs2)50psi，碰撞能35±15v。数据采集范围为50-1500da.

原始数据使用peakview2.2软件(absciex,usa)进行预处理，包括基线校正，峰提取，峰校正，标椎化和归一化，获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间。将处理后的数据导入excel中，计算qc样品的变异系数(cv％)将超过30％化合物剔除；缺失值超过50％的特征值剔除，其余的缺失值采用该特征值在所有样品中的最小值的一半进行填充。计算代谢物在羔羊肉组合成年羊肉组间的差异倍数(fc)，并借助spss22.0软件对预处理后的数据进行单因素方差分析t检验。同时，将数据导出simca14.1软件进行可视化分析。主成分分析(pca)和正交偏最小二乘分析(opls-da)被用于羔羊肉和成年羊肉中潜在差异性生物标志物的鉴别。那些变量重要性(thevariableimportanceforprojection，vip变量重要性)大于1同时单因素方差分析检验(t检验)显著性水平p值小于0.05的代谢物被认为是差异性生物标志物。

对代谢物数据进行主成分分析，判断两组样品是否存在差异。从pca得分图，如图1所示，主成分得分图，a正离子模式，b为负离子模式，可以发现qc样品聚集度较高，表明前处理和仪器状态较好。两组样品具有较好的分离度，样品全部落在95％置信区间内。正、负离子模式前四个成分对差异的累计贡献率分别为61.5％和60.1％。这说明pca模型对两组样品具有很好的鉴别能力，即羔羊肉和成年羊肉可以通过pca进行区分，也进一步说明两组样品之间存在明显的差异。随后进行正交偏最小二乘分析，建立opls-da模型(图2所示，正交偏最小二乘分析得分图，a为正离子模式，b为负离子模式)，筛选羔羊肉和成年羊肉中具有显著差异的代谢物。模型中r²x(cum)和r²y(cum)分别表示模型对x和y矩阵的解释能力，q²y(cum)表示模型的预测能力，当r²x越小，r²y和q²y越大且接近1时，模型越稳定可靠。在建立的opls-da模型中，正离子模式下r²x(cum)、r²y(cum)和q²y(cum)分别为43.3％，97.7％和88.9％，负离子模式下r²x(cum)、r²y(cum)和q²y(cum)分别为41.7％，97.4％和81.4，说明模型较稳定且预测能力好。基于opls-da模型，以vip>1,p<0.05,fc>2作为门槛值，正离子模式下获得2个潜在的特征标志物：毛茛黄质(flavoxanthin)和磷脂酸(pa)；负离子模式下获得1个潜在的特征标志物：磷脂酰肌醇(pi)，详细信息见表1。本发明中的特征性差异物是从大量数据中筛查和识别的，具备客观性和精准性，可用于高山美利奴细毛羊羔羊肉和成年羊肉的鉴别。

表1.羔羊肉和成年羊肉中的潜在特征标志物

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。