一种基于AFM探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法与流程

本发明属于微观科学领域，特别是纳米测量。具体是一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法。特别是涉及一种单分子力谱分析用原子力显微镜探针功能化修饰方法。

背景技术：

生物质作为可再生生物资源，使用生物质能源替代化石燃料已经成为必要的发展趋势。生物质具有来源广泛、价格低廉、污染少、可再生等优点，将其制备为乙醇、氢气和生物柴油等燃料及其他化学品，有利于减少化石能源的消耗。我国具有丰富的生物质资源，每年农林废弃物可达7亿多吨，其中甘蔗渣是一种重要的可再生生物质资源，来源集中、量大面广且半纤维素和纤维素含量较高，因此，采用蔗渣生物质资源制备生物乙醇能有效提高蔗渣的附加值。将蔗渣制备成生物乙醇，需要经过预处理、酶解糖化和发酵，在酶解糖化过程中，纤维素原本的结晶度和聚合度以及半纤维素和木素形成的空间障碍效应，导致酶和纤维素分子间的亲和性降低，阻碍酶解的进行。木素与纤维素酶分子之间的相互作用是抑制酶解糖化效率的主要因素，因此阐述木素与纤维素酶之间的相互作用，能为提高酶解糖化效率和生物乙醇产率提供理论研究基础。但目前，缺少采用原子力显微镜研究木素与纤维素酶之间相互作用力的研究，因此采用简单功能化方法将纤维素酶蛋白修饰在afm探针上，研究木素与酶蛋白之间的相互作用力-距曲线是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法，该方法步骤简单，操作简便，可以实现酶蛋白与木素之间力-距曲线测定。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：

1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。

2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.2～0.5mg/ml的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(hs-peg-cooh)溶液中，在室温避光条件下反应3～6h，得到表面修饰后的探针。

3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45～60℃的热水中0.5～2h，去除探针表面物理吸附的hs-peg-cooh分子，得到洗净后的探针。

4.将洗净后的探针浸入含有浓度为5～12mg/ml活化剂浓度为5～12mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和浓度为10～20mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(eds)ph为7.1～7.5的磷酸盐(pbs)缓冲液中，反应0.5～2h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。

5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.5～1mg/ml纤维素酶的pbs溶液中，在4℃避光条件下反应12～24h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入pbs溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。

6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将100～300mg木素压成圆形片，压片时间为10～30分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。

7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜样品台固定装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。

与现有技术相比本发明的有益结果：

本发明方法工艺简单，操作简便，可以实现在单分子水平测定纤维素酶与木质纤维组分之间相互作用力的目标。

附图说明

图1为本发明中原子力显微镜探针功能化修饰示意图

图2为本发明功能化修饰原子力显微镜探针的扫描电镜图

图3为本发明实施例1中测试得到的单分子力-距曲线图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施对本发明作进一步描述。

实施例1

一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：

1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。

2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.2mg/ml的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(hs-peg-cooh)溶液中，在室温避光条件下反应3h，得到表面修饰后的探针。

3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45℃的热水中0.5h，去除探针表面物理吸附的hs-peg-cooh分子，得到洗净后的探针。

4.将洗净后的探针浸入含有浓度为5mg/ml活化剂浓度为5mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和浓度为10mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(eds)ph为7.1的磷酸盐(pbs)缓冲液中，反应30分钟后，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。

5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.5mg/ml纤维素酶的pbs溶液中，在4℃避光条件下反应12h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入pbs溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。纤维素酶修饰afm探针的示意图如附图1所示。纤维素酶修饰afm探针的表面电镜图如附图2所示。

6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将100mg木素压成圆形片，压片时间为10分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。

7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用日立5100n原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。纤维素酶探针与木素之间的力-距曲线示意图如附图3所示。

实施例2

一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：

1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。

2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.4mg/ml的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(hs-peg-cooh)溶液中，在室温避光条件下反应5h，得到表面修饰后的探针。

3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入45℃的热水中1h，去除探针表面物理吸附的hs-peg-cooh分子，得到洗净后的探针。

4.将洗净后的探针浸入含有活化剂浓度为8mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和浓度为15mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(eds)ph为7.2的磷酸盐(pbs)缓冲液中，反应1h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。

5.将活化后的金探针浸入含有浓度为0.8mg/ml纤维素酶的pbs溶液中，在4℃避光条件下反应18h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入pbs溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。

6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将200mg木素压成圆形片，压片时间为20分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。

7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。

实施例3

一种基于afm探针测定酶蛋白与木素之间力曲线的方法包括如下步骤：

1.在二甲基亚砜中清洗镀金的原子力显微镜探针，探针在氮气下干燥，紫外臭氧清洗20分钟，随后用超纯水清洗，二甲基亚砜清洗，氮气干燥，得到清洗干净的探针。

2.将清洗干净的探针浸入到浓度为0.5mg/ml的二甲基亚砜为溶剂的巯基-聚乙二醇-羧基(hs-peg-cooh)溶液中，在室温避光条件下反应6h，得到表面修饰后的探针。

3.将表面修饰后的探针用二甲基亚砜洗净后，放入60℃的热水中0.5～2h2h，去除探针表面物理吸附的hs-peg-cooh分子，得到洗净后的探针。

4.将洗净后的探针浸入含有活化剂浓度为12mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和浓度为20mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(eds)ph为7.4的磷酸盐(pbs)缓冲液中，反应2h，采用超纯水清洗探针，得到活化后的金探针。

5.将活化后的金探针浸入含有浓度为1.0mg/ml的纤维素酶的pbs溶液中，在4℃避光条件下反应24h，反应后采用缓冲液清洗探针，再用超纯水清洗，最后将探针放入pbs溶液中4℃避光条件下保存备用，得到纤维素酶探针。

6.木素样品的制备：采用贝克曼法从蔗渣中分离得到磨木木素，采用红外压片机将300mg木素压成圆形片，压片时间为30分钟，然后将木素圆片固定在原子显微镜的圆形样品台上，得到含有木素样品台。

7.纤维素酶探针与木素力曲线的测定：将步骤5得到的纤维素酶的afm探针安装到原子力显微镜装置上，将含有木素样品台安装在原子力显微镜装置上，利用原子力显微镜接触模式对木素样品进行检测，获取设定数量的力曲线；在测定力曲线时，选取的点均匀分布在木素样品表面。