液-质联用鉴定异戊烯基二氢茋的方法及新化合物的结构和应用与流程

本发明属于天然药物化学技术领域，特别涉及液-质联用在动植物提取物及制剂中发现异戊烯基二氢茋(dihydrostilbenes)成分的技术方法。也涉及新的异戊烯基二氢茋成分-甘草茋d(glycytilbened)、甘草茋e(glycytilbenee)的制备、结构及生物活性，以及它们在药品、(功能)食品、化妆品、家畜饲料等方面的应用。

背景技术：

茋(二苯乙烯)类化合物，如白藜芦醇，是存在于许多药用植物、蔬菜和水果中的天然产物。有些植物，如甘草中含有异戊烯基二氢茋类成分，即α-α′键饱和并联有异戊烯基取代基[biondidm，roccoc，rubertog.dihydrostilbenederivativesfromglycyrrhizaglabraleaves.jnatprod，2005，68：1099-1102；siracusal，saijaa，cristanim，ciminof，d′arrigom，trombettad，raof，rubertog.phytocomplexesfromliquorice(glycyrrhizaglabral.)leaves--chemicalcharacterizationandevaluationoftheirantioxidant，anti-genotoxicandanti-inflammatoryactivity.fitoterapia，2011，82：546-556.]。最近，wang等人[wangl，zhangk，hans，zhangl，baih，baof，zengy，wangj，duh，liuy，yangz.constituentsisolatedfromtheleavesofglycyrrhizauralansisandtheiranti-inflammatoryactivitiesonlps-inducedraw264.7cells.molecules，2019，24：1923.]从乌拉尔甘草叶中分离出四种新的异戊烯基二氢茋，发现这些化合物有很强的抗炎活性。基于异戊烯基二氢茋的生物活性，有必要开发其快速的检测方法。本发明首先展现异戊烯基二氢茋的裂解模式，即56道尔顿的中性丢失是异戊烯基二氢茋类的特征，α-α′键断裂生成的碎片为取代基种类、数量和位置提供信息。随后，以甘草叶提取物为例，通过56道尔顿的中性丢失扫描和子离子扫描，对其中的异戊烯基二氢茋进行挖掘，鉴定了10种异戊烯基二氢茋成分。对推测的新化合物，用色谱法分离纯化，并用核磁共振波谱分析确证2种新的二氢茋衍生物--甘草茋d(glycytilbened)、甘草茋e(glycytilbenee)的结构。这些结果表明，中性丢失扫描与子离子扫描结合的液-质联用技术是从样品中发现新的异戊烯基二氢茋的可行方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种从动植物提取物、组织和细胞代谢物、制剂或相关食品、药品、化妆品、饲料等中鉴定异戊烯基二氢茋的方法(基于液-质联用的中性丢失扫描结合子离子扫描发现异戊烯基二氢茋成分的方法)，及新天然产物--甘草茋d和甘草茋e的结构、制备方法及抑制α-葡萄糖苷酶活性。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案：

对纯品异戊烯基二氢茋进行子离子扫描，寻找其裂解规律；

用56道尔顿的中性丢失扫描，获得提取物中含异戊烯基成分的色谱图；

利用子离子扫描鉴定异戊烯基二氢茋的结构；

对其中的新异戊烯基二氢茋进行针对性的分离纯化并用核磁共振法确定结构；

本发明还提供2种新异戊烯基二氢茋成分--甘草茋d和甘草茋e化学结构：

本发明的另一个方面，提供甘草茋d和/或甘草茋e的组合物；

本发明还提供含有甘草茋d和/或甘草茋e的药物制剂；

甘草茋d和甘草茋e有较强的抑制α-葡萄糖苷酶活性。α-葡萄糖苷酶抑制剂可以延缓碳水化合物吸收，降低餐后血糖水平。有的α-葡萄糖苷酶抑制剂还有抗病毒作用(kellyl.warfield.targetingendoplasmicreticulumα-glucosidaseiwithasingle-doseiminosugartreatmentprotectsagainstlethalinfluenzaanddenguevirusinfections.jmedchem，2020.https：//dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c00067)。因此，本发明还涉及含有甘草茋d和/或甘草茋e的组合物在治疗和/或预防糖尿病及病毒性疾病中的应用。

在本发明利用液-质联用技术的中性丢失扫描结合子离子扫描发现样品中异戊烯基二氢茋的一个优选方案中，异戊烯基二氢茋成分的筛查和鉴定，包括以下步骤：

1)样品用溶剂，优选甲醇或70％及以上浓度乙醇提取。提取液通过微滤器过滤后作为液-质分析用样液；

2)用液-质联用分析，优选三重四极杆质谱检测仪，反相硅胶c18分析柱，水-甲醇或水-乙腈梯度洗脱，优化色谱洗脱程序；

3)使用上面第2步优化的色谱洗脱程序联用正电离模式的质谱检测器对样品液进行56道尔顿的中性丢失扫描，以挖掘联有异戊烯基的化合物，得到色谱图；

4)使用上述第3步相同的色谱洗脱程序，在碎片电压为20-200v，优选60-170v，碰撞能为0-40ev，优选5-20ev条件下对上面第3)步所得色谱峰对应的母离子进行了负电离和正电离的子离子扫描；

5)根据二氢茋类化合物容易在α-α′键间断裂，在负电离模式下，含酚基团较多的片段(邻酚除外)表现出较强的离子峰，而在正电离模式下，含酚基团较少的片段表现出较强的离子峰的规律，对上面第3-4)得到的质谱图进行分析，推测样品中的异戊烯基二氢茋化合物数量和结构，根据峰面积定量。

本发明的优点和新发现为：

发明了一种发现新的异戊烯基二氢茋的液-质鉴定方法，即利用中性丢失(56道尔顿)与子离子扫描相结合的液-质联用技术从样品中发现新的异戊烯基二氢茋类成分的方法。利用的规律是：二氢茋类化合物容易在α-α′键之间断裂，在负电离模式下，含酚基团较多的片段(邻酚除外)表现出较强的离子峰，而在正电离模式下，含酚基团较少的片段表现出较强的离子峰。正电离模式下，异戊烯基二氢茋的中性丢失为56道尔顿。本发明为挖掘更多的含异戊烯基二氢茋动植物资源及新异戊烯基二氢茋化合物的发现提供了依据和方法。

得到了新结构的异戊烯基二氢茋衍生物--甘草茋d及甘草茋e，有望对肥胖及糖尿病或病毒感染有活性。

附图说明

图1是异戊烯基二氢茋类化合物(1-5)在负电离模式下的质谱图和裂解途径(a-e)；

图2是正电离模式下代表性异戊烯基二氢茋化合物(5)在不同碰撞能量40ev(a)、30ev(b)、20ev(c)、10ev(d)时的ms/ms图和裂解途径；

图3是异戊烯基二氢茋化合物(1-4)在正电离模式碰撞能量10ev下的ms/ms图(a-d)；

图4是甘草叶提取物的液-质联用中性丢失(56道尔顿)扫描色谱图(a)，以及化合物19-23在负电离模式下的ms/ms谱图和裂解；

图5是甘草叶成分的化学结构；

*：经lc-ms鉴定，纯化后经核磁共振确证的化合物；

#：通过lc-ms初步鉴定的化合物；

其它化合物通过与前期得到的对照物纯品比较液-质各参数鉴定了结构；

图6是新化合物甘草茋d的hmbc谱图；

图7是新化合物甘草茋e的hmbc谱图。

具体实施方式

下面对本发明的异戊烯基二氢茋衍生物的分析鉴定法做进一步详细说明。

实施例1：液-质分析用样品溶液的制备和液-质分析一般条件

将干燥的甘草叶用色谱级甲醇，以100mg∶4ml的固液比在超声作用下提取20分钟。上清液通过sep-pakc18柱及过0.22μm滤器。收集滤液中段为液-质分析用样品溶液。

用安捷伦1290infinityuhplc-dad系统和安捷伦6340三重四极杆质谱仪，安捷伦zorbaxrrhdeclipseplusc18(50mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱。进样量1μl，流速0.4ml/min。流动相以0.1％甲酸为溶剂a，乙腈为溶剂b，洗脱程序为：0min20％b、6.5min30％b、7.5min33％b、12.5min45％b、15min55％b、17min100％b、18min停止，平衡时间：2min。毛细管4.5kv，气体温度350℃，气体流量11l/min，雾化器45psi。

实施例2：异戊烯基二氢茋的质谱裂解规律

在负和正电离模式下对异戊烯基二氢茋纯品进行子离子扫描分析，获得ms/ms图。结果显示，这类化合物易发生α-α′键断裂，产生相应的碎片离子(图1-3)。

在负电离模式下，化合物1(图1a)的m/z191(含有两个酚羟基的苯基部分)峰很强，而m/z207(含有一个酚羟基的另一个苯基部分)峰很弱。化合物3(图1c)和4(图1d)的ms/ms图中也出现类似现象。化合物2(图1b)的两个苯基都含有一个酚羟基，显示出弱的子离子峰；化合物1和3-5的结构中至少有一个苯基上连有两个酚羟基，均在m/z191处显示强的子离子峰(图1a、1c和1d)。这些结果表明，在负电离模式下，含酚基较多的片段，特别是当两个酚羟基处于间位或对位时，显示出较强的离子峰。

在正电离模式下，观察到小分子的中性损失。所有异戊烯基二氢茋均出现丢失56道尔顿(异丁烯)的碎片离子(图2、3)，该中性丢失在较低的碰撞能量(10或20)(图2d和2c)时比在较高的碰撞能量(30和40)(图2b和2a)时更明显。化合物1和2的结构中含有一个2，2-二甲基-3-羟基-3，4-二氢吡喃环，显示了中性损失18道尔顿(h2o)和72道尔顿(2-甲基-丙烯-1-醇)的碎片离子(图3a和3b)。正电离模式下也有α-α′键断裂产生的碎片，与负电离模式相比，含酚基团较少的碎片在正电离模式下表现出更强的离子峰。化合物3的m/z189(含有一个酚羟基的部分)比其他碎片更强(图3c)。

实施例3：中性丢失扫描结合子离子扫描检测甘草叶中的异戊烯基化合物

由于56道尔顿的中性丢失是异戊烯基化合物的特征，因此，我们以甘草叶提取物为样品进行了56道尔顿的中性丢失扫描，以寻找其中未经鉴定的异戊烯基化合物。结果得到图4a所示的色谱图。通过与之前得到的化合物(yer，fanyh，macm.identificationandenrichmentofα-glucosidase-inhibitingdihydrostilbeneandflavonoidsfromglycyrrhizauralensisleaves.jagricfoodchem.2017，65：510-515；fanyh，yer，xuhy，fengxh，macm.structuresandinvitroantihepaticfibrosisactivitiesofprenylateddihydrostilbenesandflavonoidsfromglycyrrhizauralensisleaves.jfoodsc2019，84：1225-1230.)对照，确定化合物1和3-12所对应的峰(图4a)。之前从甘草叶中还分离鉴定出化合物2、13-18(图5)，但由于这些化合物结构不含异戊烯基，因此未出现在中性丢失色谱图中。

对没有可供比较参考的其他主要化合物进行了子离子扫描，其中5种化合物(19-23)的结构由图4所示的ms/ms质谱推出。

用液-质联用56道尔顿(图4a)的中性丢失扫描，所得色谱图中的最高峰是保留时间14.6分钟的峰(20)。该色谱峰在负电离模式下显示m/z381。扫描381的子离子得到3个化合物(19、5和20)，均具有m/z191的子离子。说明19和20在异戊烯基二氢茋2个苯基上的取代基类型和数目与化合物5中的相同，即每个苯基中有2个羟基和1个异戊烯基取代，如图5所示。

化合物22在m/z313出现[m-h]^-峰，在m/z123处出现对应于二羟基苄基结构的强子离子峰。由于该碎片离子的高强度，将这两个羟基连接到间位。从分子量上推断，另一个苯基被一个异戊烯基及2个羟基取代，由于m/z191处的子离子很弱，这两个羟基被分配到邻位。化合物22的结构如图5所示。

化合物21和23均出现m/z397的[m-h]^-峰，在m/z191处出现子离子，对应于带有一个异戊烯基及2个羟基取代的苯基，由于化合物23的m/z191的子离子强度高，因此将其羟基分配到间位，而化合物21的m/z191子离子强度弱，将其分配于邻位。根据分子量及[m-h-h2o]^-的特征子离子，推断另一个苯基上的取代模式与化合物1相同(图1a)。因此化合物21及23的结构如图5所示。

为确证液-质初步鉴定的主要化合物的结构，以这些化合物为目标，进行了液-质指导下的制备性分离、纯化和鉴定。

实施例4：制备性提取分离异戊烯基二氢茋类化合物

用甲醇超声提取甘草叶(200g)。滤液在真空下浓缩上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱。从石油醚-乙酸乙酯8∶2洗脱部分获得b组分，从石油醚-乙酸乙酯7∶3洗脱部分获得c组分。b组分经ods柱层析，水-甲醇洗脱，75％甲醇洗脱部分经葡聚糖凝胶-lh20纯化，甲醇洗脱，制备型高效液相进一步纯化得到化合物20(20mg)。制备型高效液相条件为流速10ml/min，检测波长280nm，流动相以水为溶剂a，ch3cn为溶剂b，洗脱程序为0.01min30％b，60min50％b，90-100min100％b。c组分用ods柱层析法分离，从70％甲醇洗脱部分得到c1f2。c1f2用ods柱进一步分离，40-50％ch3cn洗脱部分用制备型高效液相纯化得到化合物19(4mg)和21(2mg)。

实施例5：用核磁共振光谱确证异戊烯基二氢茋类化合物的结构

分离得到的纯品化合物19-21的核磁共振数据列在表1中。

表1化合物19-21的核磁共振数据

*：这些归属可以交换。

在19纯品的¹hnmr中，δ6.13(d，j＝2.4hz，h-6)和6.15(d，j＝2.4hz，h-4)的质子信号显示有一个苯基上有两个氢位于间位；δ6.46(h-6′)和6.56(h-5′)处的一对双峰芳香质子信号j＝7.8hz，表示另一个苯基有邻位二氢的结构。δ2.65(2h，ch2-α)和2.66(2h，ch2-α′)处的两个亚甲基质子信号与δ142.9(c-1)和131.9(c-1′)处的两个芳香碳信号相关，表明有二氢茋的骨架。在δ1.63(3h，s，h-11)、1.65(3h，s，h-11′)、1.69(3h，s，h-10)和1.73(3h，s，h-10′)有明显的甲基信号。在hmbc谱图中，δ1.63和1.69处的甲基信号以及在δ3.20处的亚甲基信号(d，j＝6.6hz，h-7)与δ124.3(c-8)和129.4(c-9)处的芳香碳信号相关，表明19的结构中存在异戊烯基。δ1.65、1.73处的另一对甲基信号和δ3.32(d，j＝6.6hz，h-7′)处的亚甲基质子信号与δ123.7(c-8′)和130.1(c-9′)处的碳信号相关，表明19中存在另一个异戊烯基。两个异戊烯基的取代位置由hmbc谱中h-7与c-1、c-2和c-3以及h-7′与c-1′、c-2′和c-3′的相关性确定。根据上述证据，化合物19确定为如图5所示的结构。这是一种新的化合物，命名为甘草茋d，其hmbc光谱见图7。

化合物20的¹hnmr显示了一对位于δ6.51(d，j＝1.8hz，h-6)和6.40(d，j＝1.8hz，h-2)的苯环上间位氢信号，以及苯环上两个对称氢信号δ6.18(2h，s，h-2′，6′)。此外，在核磁共振谱中还发现了两个异戊烯基，并用hmbc测定了它们的位置。核磁共振数据表明化合物20的结构如图5所示。该化合物已被报道存在于甘草属植物种(biondidm，roccoc，rubertog.newdihydrostilbenederivativesfromtheleavesofglycyrrhizaglabraandevaluationoftheirantioxidantactivity.jnatprod2003，66：477-480)。

化合物21的¹h-nmr谱在δ6.16(1h，j＝1.8hz，h-2)、6.12(1h，j＝1.8hz，h-6)和6.45(1h，d，j＝2.4hz，h-2′)、6.34(1h，d，j＝2.4hz，h-6′)处显示了两对间位偶合的苯基上氢信号。在hmbc谱中，δ2.64和2.65处的亚甲基质子信号(ch2-α和ch2-α′)与δ141.3和132.8处的两个芳香碳信号(c-1和c-1′)相关，表明其有二氢茋骨架。在δ1.21/1.30(各3h，s，h-10，11)、1.70(3h，s，h-10′)和1.72(3h，s，h-11′)处有4个甲基信号。δ1.70和1.72处的甲基信号在hmbc谱中与δ122.9(c-8′)和131.1(c-9′)处的一对烯烃碳信号均显示出远程相关。δ3.24(2h，d，j＝7.5hz，h-7′)处的亚甲基质子信号也与这两个烯烃碳有hmbc相关。上述信息显示化合物21个结构中有一个异戊烯基。在δ1.21/1.30处的另两个甲基信号和δ2.53/2.49处的亚甲基信号与δ69.3(c-8)和76.1(c-9)处的含氧碳有hmbc相关，表明存在2，2-二甲基-3-羟基-3，4-二氢吡喃环。由于h-7′与c-4′、c-5′和c-6′之间的hmbc相关性，所以异戊烯基的位置确定在c-5′上。由于h-7与c-3、c-4和c-5的hmbc相关，所以在c-4和c-5位置形成了2，2-二甲基-3-羟基-3，4-二氢吡喃环。以上核磁共振分析证实21的结构如图5所示。这是一种新化合物，名为甘草茋e，其hmbc光谱见图7。

实施例6：甘草叶化学成分的定量分析

对照化合物(1-18)溶解在dmso中，每种化合物的浓度为20μg/ml，然后用dmso进行三倍系列稀释。使用每种化合物的优化碎片电压和碰撞能量(表2)，用液-质多反应监测(mrm)模式进行定量。

表2质谱定量检测条件

表3所示的定量结果显示，2018年和2019年在内蒙古鄂尔多斯采集的甘草叶中含有化合物19-21和大多数先前报道的化合物。异戊烯基黄酮类化合物(10)和两种异戊烯基二氢茋类化合物(5和20)的含量最高，在1g干燥的甘草叶中的含量均超过100微克。

表3甘草叶中化合物的含量

注：nd：含量低于定量限。

实施例7：对α-葡萄糖苷酶抑制活性

对α-葡萄糖苷酶的抑制作用实验在96孔板上进行，测试化合物溶于dmso中。每孔含有10微升待试液(对照孔加入等量dmso)、80微升2毫摩尔的4-硝基苯基α-d-吡喃葡萄糖甙(溶解于100毫摩尔ph值为7.09的磷酸钾缓冲液)和10微升0.40u/mlbacillusstearothermophilusα-葡萄糖苷酶。37℃孵育20分钟后，用酶标仪测量405nm处的吸光度。抑制率计算公式为：抑制率％＝(对照孔的吸光值-样品孔的吸光值)/对照孔的吸光值。每种化合物以100、10、1和0.1微克/毫升的最终浓度进行三次试验。50％抑制浓度ic50值从抑制率-浓度曲线中获得。

在先前报道(fanyh，yer，xuhy，fengxh，macm.structuresandinvitroantihepaticfibrosisactivitiesofprenylateddihydrostilbenesandflavonoidsfromglycyrrhizauralensisleaves.jfoodsci2019，84：1225-1230.)的甘草叶异戊烯基二氢茋类化合物中，化合物5(ic50＝3μg/ml)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强。因此，对新分离到的化合物19-21的活性进行了测试，并与化合物5进行了比较。所有新分离的异戊烯基二氢茋均显示出对α-葡萄糖苷酶的抑制活性：19(ic50＝4μg/ml)、20(ic50＝8μg/ml)、21(ic50＝4μg/ml)。化合物19和21显示出与化合物5相当的抑制活性。

综上，本发明公开了一种用液-质联用快速检测异戊烯基二氢茋的方法，并证明甘草叶中含有丰富的酚类成分。从甘草叶共鉴定出23种酚类成分，其中10种异戊烯基二氢茋类成分，13种为黄酮类化合物。液-质法预测的新化合物经色谱法纯化后通过核磁共振谱的解析得到验证。新分离的异戊烯基二氢茋对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。

本发明公开的快速检测动植物样品中异戊烯基二氢茋类化合物的方法(中性丢失扫描56道尔顿，结合子离子扫描)，可全面鉴定动植物提取物、动植物组织及细胞代谢物中的异戊烯基二氢茋。研究结果为被测试物作为药品或保健食品的开发利用提供参考，同时也为制备具有生物活性的先导化合物提供有价值的来源。

上述仅为本发明较佳的具体实施例，本发明保护范围不应受到此限制，熟悉本领域的技术人员在本发明的技术范围内，以简单变化或替换所获得的技术方案均落入本发明的保护范围。