本发明涉及霉变分析检测技术领域，尤其涉及一种基于蒎烯的指示剂及其使用方法和应用。
背景技术：
香烟是人们生活中常见的物品，随着人们地香烟需求量的增加以及香烟加工厂产能的增加，作为香烟最重要原料的烟草而言，加工厂需要囤积大量的储备原料。然而烟草中丰富的糖、果胶质、有机酸等成分是微生物生长的良好基质，再加上烟草在运输和存储过程中受到环境中霉菌以及烟草温度、湿度、所含水分等因素的影响，使得烟草常发生霉变的现象。烟草霉变既会影响烟草的品质，进而导致香烟的生产品质，同时又会给生产厂家造成经济损失。所以在烟草的存储和运输过程中，霉变的检测尤为重要。
目前企业检测烟草霉变的方法主要有人工检测、微生物检测和气相-质谱联用仪检测。第一，人工检测操作简单，小批量检测样品的适用性强，但需要具有丰富烟草霉变鉴别能力的专业人士，且检测效率和准确率低，人为误差大，霉变初期很难检测出；第二，微生物检测，检测的环境要求高，需要进行培养，耗时较长，且专业性强，但优点是准确率较人工检测显著提高；第三，气相-质谱联用仪检测，对实验环境的要求高，检测设备价格昂贵，对于中小型企业而言设备的购买、养护以及人员的配备能力不足，到检测中心检测，耗费成本高，且需要进行排队等候，检测结果不及时，常会导致霉变的加重。基于现有技术存在的不足，我们提出一种基于蒎烯的指示剂及其使用方法和应用。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的检测准确率低、检测设备和环境要求高、检测成本高、检测的时效性差的不足，而提出的一种基于蒎烯的指示剂及其使用方法和应用。
一种基于蒎烯的指示剂，包括以下重量份的原料：蒎烯1.3～1.7份、聚乙二醇单甲醚0.03～0.05份、乙醚100～120份、氯仿20～24份。
优选的，所述基于蒎烯的指示剂包括以下重量份的原料：蒎烯1.5份、聚乙二醇单甲醚0.04份、乙醚110份、氯仿22份。
优选的，所述蒎烯为α-蒎烯(英文名称：2,6,6-trimethylbicy-clo[3,1,1]hept-2-ene)。
本发明还提出了一种基于蒎烯的指示剂的使用方法，包括以下步骤：
s1、烟草的预处理：取烟草样品研磨，过筛，得烟草末，按重量计，取烟草末100份、特丁基对苯二酚3份、混合溶剂3～4份，置于反应器中，于60℃搅拌30min，加入1～2份的盐酸95％乙醇溶液，升温至70～80℃搅拌反应40min，再升温至90℃，加入3～5份的氢氧化钾95％乙醇溶液，反应50min，冷却至室温加适量萃取剂，萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，干燥即得烟草提取物；
s2、烟草提取物的溶解：称取步骤s1制备得到的烟草提取物质量，并按照质量比为1：10～20加入混合溶剂，超声20min，冷却至室温即得烟草提取液；
s3、预混合过程：将步骤s2得到的烟草提取液与烟草提取液质量0.004～0.014倍的环氧氯丙烷、烟草提取液质量0.005～0.01倍的高氯酸铜、烟草提取液质量1.1～1.4倍的二甲基甲酰胺、烟草提取液质量0.5～0.8倍的甲苯，依次加入到三口反应瓶中，在三口反应瓶中间瓶口和一侧瓶口处增加恒压分液漏斗，分别为漏斗a和漏斗b，且另一侧瓶口使用瓶塞塞紧，恒压分液漏斗保持关闭状态，边升温边搅拌至反应瓶中温度达到80℃，保持恒温和搅拌，待用；
s4、指示剂的霉变检测过程：
a、向步骤s3漏斗a中注入基于蒎烯的指示剂，漏斗b中注入甲醇，记录基于蒎烯的指示剂的注入体积；
b、开启漏斗a，滴速为0.2ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，搅拌30min，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭漏斗b，打开瓶塞取样tlc跟踪监测蒎烯是否反应完全，若蒎烯反应完全则进行步骤c，若蒎烯反应不完全进行步骤d；
c、开启漏斗a，且滴速为0.1ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测蒎烯是否完全，若蒎烯反应完全则重复步骤c，若蒎烯反应不完全则进行步骤d；
d、开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加20min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测蒎烯是否完全，若蒎烯反应完全则重复步骤c，若蒎烯反应不完全则记录漏斗a中基于蒎烯的指示剂的剩余体积，完成霉变的检测。
优选的，步骤s1中所述过筛所使用的筛网目数不小于18目。
优选的，步骤s1和步骤s2中，所述混合溶剂为体积比为4～3：2的甲醇和正己烷的混合物。
优选的，步骤s1中所述萃取剂为饱和食盐水和正己烷的混合物，且饱和食盐水和正己烷的体积比为1：8～10。
本发明提出的一种基于蒎烯的指示剂用于对烟草中霉变情况进行检测和霉变等级判定。
优选的，所述霉变等级的判定方法为：根据漏斗a中基于蒎烯的指示剂注入体积与剩余体积的差值，得到基于蒎烯的指示剂的消耗量，根据基于蒎烯的指示剂的消耗量判定烟草霉变等级，完成霉变的判定。
优选的，所述烟草霉变等级为：0级霉变、消耗量为10ml及以下，1级霉变、消耗量为10～14ml，且不包括10ml、包括14ml，2级霉变、消耗量为14～20ml，且不包括14ml、包括20ml，3级霉变、消耗量为大于20ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提出的指示剂，以蒎烯为主要指示物质，辅以聚乙二醇单甲醚、乙醚和氯仿的加入，可以提高蒎烯的稳定性，防止自身氧化，保证指示剂的流动性，以及保证蒎烯在霉变指示过程中均匀的分散在反应体系中，与烟草提取液充分接触反应，进而提高指示剂检测霉变的准确性；
2、在使用过程中，仅需对烟草样品进行简单的常规处理，即可得到烟草提取液，在环氧氯丙烷、高氯酸铜、二甲基甲酰胺、甲苯的作用下使蒎烯与烟草提取液进行反应，消耗蒎烯，并通过消耗的指示剂的量来判定霉变等级，整个检测过程所需原料廉价易得，操作过程简单，检测成本低，且所需设备和环境需求低，中小型企业也能拥有自己的检测中心，降低检测费用，提高企业利润率；
3、在指示剂使用过程中以合理比例甲醇和正己烷配制得到的混合溶剂既在烟草样品的预处理过程中使用，提高烟草中被指示物的提取效率，同时在烟草提取液的配制过程中也是用，可以减少所需试剂的种类，避免过多种类试剂对指示准确度的影响；
4、在霉变检测过程中，利用tlc跟踪监测反应体系中蒎烯的反应情况，并根据反应情况调整漏斗a和漏斗b的开启/关闭，既确保tlc所取样品的均一性，同时又保证漏斗a消耗量计算的准确性，为霉变判定提供必要前提，进而提高霉变等级判定的准确性，而且可以在短时间内得到烟草霉变判定结果，时效性强；经实验确认，本发明提出的指示剂和使用方法可以应用到烟草的霉变检测，且准确性高，相比于气相-质谱联用仪，准确率可以达到95％以上，且能有效解决传统霉变检测中检测准确率低、检测设备和环境要求高、检测成本高、检测的时效性差的不足，同时本发明提出的指示剂也可以应用于农产品霉变的检测，具有良好的发展前景，值得推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
本发明提出的一种基于蒎烯的指示剂，包括以下重量份的原料：(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯(英文名称：(1r)-2,6,6-trimethylbicyclo[3,1,1]hept-2-ene)1.7份、聚乙二醇单甲醚0.03份、乙醚120份、氯仿24份。
一种基于蒎烯的指示剂的使用方法，包括以下步骤：
s1、烟草的预处理：取烟草样品研磨，过30目筛，得烟草末，按重量计，取烟草末100份、特丁基对苯二酚3份、混合溶剂4份，所述混合溶剂为体积比为4：2的甲醇和正己烷的混合物，置于反应器中，于60℃搅拌30min，加入2份的盐酸95％乙醇溶液，升温至80℃搅拌反应40min，再升温至90℃，加入3份的氢氧化钾95％乙醇溶液，反应50min，冷却至室温加适量萃取剂，萃取3次，所述萃取剂为饱和食盐水和正己烷的混合物，且饱和食盐水和正己烷的体积比为1：8，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，干燥即得烟草提取物；
s2、烟草提取物的溶解：称取步骤s1制备得到的烟草提取物质量，并按照质量比为1：20加入混合溶剂，超声20min，冷却至室温即得烟草提取液；
s3、预混合过程：将步骤s2得到的烟草提取液与烟草提取液质量0.014倍的环氧氯丙烷、烟草提取液质量0.01倍的高氯酸铜、烟草提取液质量1.1倍的二甲基甲酰胺、烟草提取液质量0.8倍的甲苯，依次加入到三口反应瓶中，在三口反应瓶中间瓶口和一侧瓶口处增加恒压分液漏斗，分别为漏斗a和漏斗b，且另一侧瓶口使用瓶塞塞紧，恒压分液漏斗保持关闭状态，边升温边搅拌至反应瓶中温度达到80℃，保持恒温和搅拌，待用；
s4、指示剂的霉变检测过程：
a、向步骤s3漏斗a中注入基于蒎烯的指示剂，漏斗b中注入甲醇，记录基于蒎烯的指示剂的注入体积；
b、开启漏斗a，滴速为0.2ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，搅拌30min，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭漏斗b，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否反应完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则进行步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全进行步骤d；
c、开启漏斗a，且滴速为0.1ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则进行步骤d；
d、开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加20min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则记录漏斗a中基于蒎烯的指示剂的剩余体积，根据漏斗a中注入体积与剩余体积的差值，得到基于蒎烯的指示剂的消耗量，再根据基于蒎烯的指示剂的消耗量判定烟草霉变等级，所述烟草霉变等级为：0级霉变、消耗量为10ml及以下，1级霉变、消耗量为10～14ml，且不包括10ml、包括14ml，2级霉变、消耗量为14～20ml，且不包括14ml、包括20ml，3级霉变、消耗量为大于20ml，判定结束，即完成霉变的检测。
取33份烟草样品，每份样品均分为2组，分别为对照组和实施例组，对照组采用气相-质谱联用仪进行霉变检测，判定霉变等级，实施例组用本发明实施例1的指示剂及使用方法检测烟草霉变情况，判断烟草霉变等级；对照组与实施例组霉变判定相同份数为32份，即相比于对照组的准确率为97％。
实施例2
本发明提出的一种基于蒎烯的指示剂，包括以下重量份的原料：(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯1.3份、聚乙二醇单甲醚0.05份、乙醚100份、氯仿20份。
一种基于蒎烯的指示剂的使用方法，包括以下步骤：
s1、烟草的预处理：取烟草样品研磨，过18目筛，得烟草末，按重量计，取烟草末100份、特丁基对苯二酚3份、混合溶剂3份，所述混合溶剂为体积比为3：2的甲醇和正己烷的混合物，置于反应器中，于60℃搅拌30min，加入1份的盐酸95％乙醇溶液，升温至70℃搅拌反应40min，再升温至90℃，加入5份的氢氧化钾95％乙醇溶液，反应50min，冷却至室温加适量萃取剂，萃取3次，所述萃取剂为饱和食盐水和正己烷的混合物，且饱和食盐水和正己烷的体积比为1：10，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，干燥即得烟草提取物；
s2、烟草提取物的溶解：称取步骤s1制备得到的烟草提取物质量，并按照质量比为1：10加入混合溶剂，超声20min，冷却至室温即得烟草提取液；
s3、预混合过程：将步骤s2得到的烟草提取液与烟草提取液质量0.004倍的环氧氯丙烷、烟草提取液质量0.005倍的高氯酸铜、烟草提取液质量1.4倍的二甲基甲酰胺、烟草提取液质量0.5倍的甲苯，依次加入到三口反应瓶中，在三口反应瓶中间瓶口和一侧瓶口处增加恒压分液漏斗，分别为漏斗a和漏斗b，且另一侧瓶口使用瓶塞塞紧，恒压分液漏斗保持关闭状态，边升温边搅拌至反应瓶中温度达到80℃，保持恒温和搅拌，待用；
s4、指示剂的霉变检测过程：
a、向步骤s3漏斗a中注入基于蒎烯的指示剂，漏斗b中注入甲醇，记录基于蒎烯的指示剂的注入体积；
b、开启漏斗a，滴速为0.2ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，搅拌30min，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭漏斗b，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否反应完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则进行步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全进行步骤d；
c、开启漏斗a，且滴速为0.1ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则进行步骤d；
d、开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加20min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则记录漏斗a中基于蒎烯的指示剂的剩余体积，根据漏斗a中注入体积与剩余体积的差值，得到基于蒎烯的指示剂的消耗量，再根据基于蒎烯的指示剂的消耗量判定烟草霉变等级，所述烟草霉变等级为：0级霉变、消耗量为10ml及以下，1级霉变、消耗量为10～14ml，且不包括10ml、包括14ml，2级霉变、消耗量为14～20ml，且不包括14ml、包括20ml，3级霉变、消耗量为大于20ml，判定结束，即完成霉变的检测。
取27份烟草样品，每份样品均分为2组，分别为对照组和实施例组，对照组采用气相-质谱联用仪进行霉变检测，判定霉变等级，实施例组用本发明实施例2的指示剂及使用方法检测烟草霉变情况，判断烟草霉变等级；对照组与实施例组霉变判定相同份数为26份，即相比于对照组的准确率为96.3％。
实施例3
本发明提出的一种基于蒎烯的指示剂，包括以下重量份的原料：(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯1.5份、聚乙二醇单甲醚0.04份、乙醚110份、氯仿22份。
一种基于蒎烯的指示剂的使用方法，包括以下步骤：
s1、烟草的预处理：取烟草样品研磨，过20目筛，得烟草末，按重量计，取烟草末100份、特丁基对苯二酚3份、混合溶剂3份，所述混合溶剂为体积比为4：2的甲醇和正己烷的混合物，置于反应器中，于60℃搅拌30min，加入2份的盐酸95％乙醇溶液，升温至75℃搅拌反应40min，再升温至90℃，加入4份的氢氧化钾95％乙醇溶液，反应50min，冷却至室温加适量萃取剂，萃取3次，所述萃取剂为饱和食盐水和正己烷的混合物，且饱和食盐水和正己烷的体积比为1：9，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，干燥即得烟草提取物；
s2、烟草提取物的溶解：称取步骤s1制备得到的烟草提取物质量，并按照质量比为1：15加入混合溶剂，超声20min，冷却至室温即得烟草提取液；
s3、预混合过程：将步骤s2得到的烟草提取液与烟草提取液质量0.008倍的环氧氯丙烷、烟草提取液质量0.008倍的高氯酸铜、烟草提取液质量1.3倍的二甲基甲酰胺、烟草提取液质量0.7倍的甲苯，依次加入到三口反应瓶中，在三口反应瓶中间瓶口和一侧瓶口处增加恒压分液漏斗，分别为漏斗a和漏斗b，且另一侧瓶口使用瓶塞塞紧，恒压分液漏斗保持关闭状态，边升温边搅拌至反应瓶中温度达到80℃，保持恒温和搅拌，待用；
s4、指示剂的霉变检测过程：
a、向步骤s3漏斗a中注入基于蒎烯的指示剂，漏斗b中注入甲醇，记录基于蒎烯的指示剂的注入体积；
b、开启漏斗a，滴速为0.2ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，搅拌30min，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭漏斗b，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否反应完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则进行步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全进行步骤d；
c、开启漏斗a，且滴速为0.1ml/min，滴加10min后，停止漏斗a滴加，开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加10min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则进行步骤d；
d、开启漏斗b，滴速为1ml/min，滴加20min，关闭b漏斗，打开瓶塞取样tlc跟踪监测(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯是否完全，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应完全则重复步骤c，若(1r)-2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-2-烯反应不完全则记录漏斗a中基于蒎烯的指示剂的剩余体积，根据漏斗a中注入体积与剩余体积的差值，得到基于蒎烯的指示剂的消耗量，再根据基于蒎烯的指示剂的消耗量判定烟草霉变等级，所述烟草霉变等级为：0级霉变、消耗量为10ml及以下，1级霉变、消耗量为10～14ml，且不包括10ml、包括14ml，2级霉变、消耗量为14～20ml，且不包括14ml、包括20ml，3级霉变、消耗量为大于20ml，判定结束，即完成霉变的检测。
取35份烟草样品，每份样品均分为2组，分别为对照组和实施例组，对照组采用气相-质谱联用仪进行霉变检测，判定霉变等级，实施例组用本发明实施例3的指示剂及使用方法检测烟草霉变情况，判断烟草霉变等级；对照组与实施例组霉变判定相同份数为35份，即相比于对照组的准确率为100％。
采用气相色谱-质谱联用仪判定霉变等级依据：
0级霉变：麦角甾醇含量为160mg/kg及以下；
1级霉变：麦角甾醇含量160～256mg/kg，且不包括160mg/kg、包括256mg/kg；
2级霉变：麦角甾醇含量256～448mg/kg，且不包括256mg/kg、包括448mg/kg；
3级霉变：麦角甾醇含量大于448mg/kg。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。