心肌肌钙蛋白I检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，尤其涉及一种心肌肌钙蛋白i检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

目前市面上常见的检测心肌肌钙蛋白i(tnl)的方法是荧光免疫法，均基于带结合垫的试剂条(见图1)。这种试剂条具有样本垫1、吸收垫2、结合垫3以及nc膜4(硝酸纤维素膜)，nc膜4具有质控线5、测试线6和测试线7。因这种方法直接将与抗原结合的荧光标记的tni抗体络合物和质控络合物包被在试剂条的结合垫上，当样本流经结合垫时，样本中的抗原与包被的荧光标记的tni抗体络合物和质控络合物反应时间短，可能反应不完全，导致精密度较差。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的一个目的是提供一种心肌肌钙蛋白i检测试剂盒，其提高了心肌肌钙蛋白i检测的精密度和灵敏度，同时还改善了产品的稳定性。

本发明的又一个目的是提供一种心肌肌钙蛋白i检测方法，其提高了心肌肌钙蛋白i检测的精密度和灵敏度。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种心肌肌钙蛋白i检测试剂盒，所述试剂盒装有：

探测颗粒，其含有荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物以及荧光标记的质控络合物。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒，所述试剂盒装有反应缓冲液。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述探测颗粒与所述反应缓冲液各自盛放于独立的容器中。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述试剂盒装有不具有结合垫的试剂条。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述探测颗粒还含有牛血清白蛋白和防腐剂。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述反应缓冲液还含有磷酸盐、牛血清白蛋白和防腐剂。

本发明还提供了一种心肌肌钙蛋白i检测方法，包括：利用所述的试剂盒检测样本中的心肌肌钙蛋白i。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测方法中，包括：利用所述反应缓冲液溶解所述探测颗粒；加入所述样本。

优选的是，所述的心肌肌钙蛋白i检测方法中，所述样本类型为全血、血清和血浆。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明将现有技术中包被在结合垫上的荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物和质控络合物制作成探测颗粒，解决了tni测试精密度和灵敏度差的问题，同时提高了tni试剂盒的稳定性。。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为现有技术中心肌肌钙蛋白i检测的试剂条的示意图；

图2为本发明所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒的一个实施例的示意图；

图3为本发明所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒的一个实施例的试剂条的示意图；

图4为一致性试验中检测tni血清样本所得到的实验系统血清检测值与对照系统血清检测值的相关分析图；

图5为一致性试验中检测tni血清和同源血浆样本所得到的实验系统血清检测值与实验系统血浆检测值的相关分析图；

图6为一致性试验中检测tni血清和同源全血样本所得到的实验系统血清检测值与实验系统全血检测值的相关分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图2所示，本发明提供了一种心肌肌钙蛋白i检测试剂盒，所述试剂盒装有：探测颗粒8，其含有荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物以及荧光标记的质控络合物。

本发明将荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物和质控络合物制作成固体小球，在反应时只需加入相应的溶剂，即可将荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物和质控络合物溶解，这时再加入样本，混合，即可让样本中的抗原与荧光标记的tni抗体络合物、生物素标记的tni抗体络合物和质控络合物充分反应，同时提高了反应的灵敏度。

本发明一方面提高了心肌肌钙蛋白i检测的精密度、灵敏度，另一方面，由于荧光标记的tni抗体络合物和质控络合物是冷藏保存，所以改善了产品的稳定性。

质控络合物可以是anti-chickenigy。

优选地，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒，所述试剂盒装有反应缓冲液。

优选地，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述探测颗粒8与所述反应缓冲液9各自盛放于独立的容器中，以进一步提高产品的稳定性。

如图3所示，在一个优选的实施例中，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述试剂盒装有不具有结合垫的试剂条。

试剂条具有样本垫1、吸收垫2、以及nc膜3(硝酸纤维素膜)，nc膜3具有质控线4、测试线5和测试线6。应用该试剂条，可以实现对于样本中心肌肌钙蛋白i的检测。

在一个优选的实施例中，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述探测颗粒还含有牛血清白蛋白和防腐剂。

在一个优选的实施例中，所述的心肌肌钙蛋白i检测试剂盒中，所述反应缓冲液还含有磷酸盐、牛血清白蛋白和防腐剂。

本发明还提供了一种心肌肌钙蛋白i检测方法，包括：利用所述的试剂盒检测样本中的心肌肌钙蛋白i。

优选地，所述的心肌肌钙蛋白i检测方法中，包括：利用所述反应缓冲液溶解所述探测颗粒；加入所述样本。

检测时，首先将探测物质(探测颗粒)、反应缓冲液混合，再加入血样混合，探测物质中荧光标记的tni抗体络合物就会与血液中的tni抗原结合形成抗体-抗原复合物，混合样本再加入到试剂条的样本垫上，通过毛细血管作用在硝化纤维基质的测试带上扩散，该复合物被测试带上的链霉亲和素所捕获，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物。因此，当血液中的tni抗原越多，测试带上的夹心复合物积聚的也多。荧光信号的强度反映了被捕获的tni抗原数量，经过配套的免疫荧光分析仪的判读，能够检测出血液样本中tni抗原的浓度。

优选地，所述的心肌肌钙蛋白i检测方法中，所述样本类型为全血、血清和血浆。

实施例1试剂条的制作过程

购买并筛选高质量的单克隆抗体，进行配对实验，筛选出特异性高、亲和力好的捕获抗体和检测抗体。用包被稀释液分别将链霉亲和素浓度调整到1-10mg/ml，chickenigy0.01-5mg/ml。

抗体包被：准备好硝酸纤维素膜并正确置于贴膜设备上，将硝酸纤维素膜粘贴在垫卡上，设定喷涂设备喷涂量为1μl/cm，喷涂速度为9cm/s，将检测线和质控线平行喷涂于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔2-3mm，然后置于烘箱中，在37℃下烘干30-120分钟。

试剂条贴膜及切割：将样本垫正确粘贴在垫卡宽面侧,要求垫压在硝酸纤维素膜上1-2mm，吸收垫粘贴在垫卡窄面侧,要求垫压在硝酸纤维素膜上方,且离底板外边缘在0-1mm。设定切割设备试纸条切割宽度为3.9mm，确认切断面是否平整。

试剂条组装：在底壳上正确安装试纸条,吸收垫应装在壳的终端，合上上壳，置于压壳设备上压牢，得到反应板(试剂条)备用。

实施例2反应缓冲液以及探测颗粒的制备过程

反应缓冲液制作：先在纯化水中加入200-600mm的nacl、10-200mm的tris、0.01-0.5％的nan3、0.1-3％的tween20、0.01-0.5％的igepalca-630，待以上组分完全溶解后，用盐酸调节溶液的ph至7-9，混匀，用磷酸盐缓冲液定容，过滤，2-8℃保存。

探测物质(探测颗粒)制作：

配制探测物质溶液：基础缓冲液组成为:0.05％-10％bsa,0.05％-5％sucrosein1xpbs，在基础缓冲液组分中分别添加适量的抗体络合物，配制得到含0.1-10ug/ml生物素标记tni抗体络合物和eu标记anti-chickenigy抗体络合物的第一份探测物质；在基础缓冲液组分中添加适量的抗体络合物，配制得到含1-10ug/mleu标记tni抗体络合物的第二份探测物质。用搅拌机搅拌上述溶液1小时使其混匀。取0.01-0.5ug第一份探测物质和0.1-2ug第二份探测物质放入同一瓶试管中混合后再放入适量的反应缓冲液以及质控品，确认其检测结果是否与预期值相近。确认检测结果无误后可进行探测物质分装。

探测物质分装及冻干：在探测物质分装机上安装20-80ul移液头，分装(20-80ul)后称试管重量，确认分装的试管重量和孔试管重量的差是否与分装容量一致，确认分装的分装容量一致后，在探测物质分装机上输入分装次数后开始分装。完成分装后缓慢抬起分装机夹具，移除后，使用过滤网分离探测物质。将得到的探测物质转移至不锈钢容器中，确认冻干机机床的温度后放入冻干机冻干探测物质。完成冻干的探测物质储存在“18-28℃，湿度<10％”。

实施例3添加公式以及制造id芯片

取已进行中间产品检测合格的反应板(试剂条)、缓冲液，tni校准品，每个校准品至少有5个浓度，每个浓度至少测试5次，将各个浓度校准品面积扫描图的平均值与浓度做标准曲线，得到线性方程，将方程式的数值导入专用软件中，将空白的原始芯片连接至电脑，通过专用软件即可将数值代码导入芯片，贴好芯片标签。

实施例4.精密度试验

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000或a5000)进行精密度实验。

1.检测材料：心肌标记物质控物，每个项目选择低、高两个浓度，具体浓度见表1。

表1检测材料的浓度

2.试验方法：

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000)对本发明的试剂盒进行精密度检测，每个浓度重复测定20次。a2000操作步骤如下：

1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。

2)用移液器取反应缓冲液150μl，放入探测物质试管(即盛放有探测颗粒的试管)。并立即用移液器采样(全血、血清、血浆50μl)并放入装有反应缓冲液的探测物质试管。

3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。

4)用移液器取75μl的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。

5)在室温反应12分钟。

6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。

3.试验结果分析：

按照试验方法对质控品进行检测，并分析检测结果。

4.试验结果：

表2.tni检测结果

由表2可以看出，tni的低值和高值质控品重复测定20次后计算平均值，标准差和cv，所得结果可见本发明的试剂盒在测定tni低值样本时cv为5.54％，高值样本的cv为3.90％，高、低值cv值均＜10％，表明本发明制备的试剂盒精密度良好，适用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需求。

实施例5.准确度试验

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000或a5000)进行准确度实验。

1.检测材料：

tn-i有证标准物质，浓度为5.00ng/ml。

2.试验方法：

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000)对本发明的试剂盒进行准确度检测，重复测定3次。a2000操作步骤如下：

1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。

2)用移液器取反应缓冲液150μl，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血清、血浆50μl)并放入装有反应缓冲液的探测物质试管。

3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。

4)用移液器取75μl的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。

5)在室温反应12分钟。

6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。

3.试验结果分析：

按照试验方法对有证标准物质进行检测，并分析检测结果。

4.试验结果：

表3.tni检测相对偏差

由表3可以看出，对tni有证标准物质重复测定3次后计算相对偏差，所得结果可见本发明的试剂盒在测定tni有证标准物质时相对偏差为1.20％～2.40％，相对偏差＜10％，表明本发明制备的试剂盒准确度良好，适用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需求。

实施例6.一致性试验

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000或a5000)进行一致性实验。

1.检测材料：

临床样本由相关医院提供，共100例酶免法定值样本，包含血清、同源血浆和同源全血，tni含量分布区间是0.01-15ng/ml。

2.试验方法：

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000)对本发明的试剂盒进行一致性检测，重复测定1次。a2000操作步骤如下：

1)打开反应板包装袋，取出反应板并水平放置。

2)用移液器取反应缓冲液150μl，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血清、血浆50μl)并放入装有反应缓冲液的探测物质试管。

3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。

4)用移液器取75μl的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。

5)在室温反应12分钟。

6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。

3.试验结果分析：

按照试验方法对100例酶免法定值样本进行检测，以血清检测结果为基准，分析各样本类型的相关关系。

由附图4可知，以对照系统血清检测值为x轴，实验系统血清检测值为y轴，绘制散点图，进行相关性分析。对100例临床血清样本进行检测，样本平均相对偏差小于10％，r2≧0.98，斜率在0.9～1.1范围内，表明本发明制备的试剂盒与酶免法试剂盒在检测tni血清时一致性良好，满足临床检测tni血清的需要。

由附图5可知，以实验系统血清检测值为x轴，实验系统血浆检测值为y轴，绘制散点图，进行相关性分析。对100例临床血浆样本进行检测，样本平均相对偏差小于10％，r2≧0.98，斜率在0.9～1.1范围内，表明本发明制备的试剂盒在检测tni血清和同源血浆样本时一致性良好，满足临床检测tni血浆的需要。

由附图6可知，以实验系统血清检测值为x轴，实验系统全血检测值为y轴，绘制散点图，进行相关性分析。对100例临床全血样本进行检测，样本平均相对偏差小于10％，r2≧0.98，斜率在0.9～1.1范围内，表明本发明制备的试剂盒在检测tni血清和同源全血样本时一致性良好，满足临床检测tni全血的需要。

实施例7.本发明制备的试剂盒与现有试剂盒性能对比

为了说明本发明制备的试剂盒与现有的带结合垫的试剂盒的性能差异，现进行性能对比测试研究。

1.检测材料：

临床样本由相关医院提供，共20例酶免法定值血清样本，tni含量分布区间是0.01-15ng/ml。

带结合垫的tni试剂盒及配套仪器购自相关代理商。

2.试验方法：

使用与本发明的试剂盒配套的荧光免疫分析仪(型号：a2000)对本发明的试剂盒进行一致性检测，每个样本重复测定5次。同时用带结合垫的tni试剂盒同时对20个血清样本进行检测，每个样本重复检测5次。a2000操作步骤如下：

1)打开反应板(试剂条)包装袋，取出反应板并水平放置。

2)用移液器取反应缓冲液150μl，放入探测物质试管。并立即用移液器采样(全血、血清、血浆50μl)并放入装有反应缓冲液的探测物质试管。

3)盖上缓冲液试管的盖子，摇晃10～15次以确保充分混匀。

4)用移液器取75μl的样本混合液，并加样到反应板的样本孔。

5)在室温反应12分钟。

6)把反应后的反应板插入专用检测设备进行测试。

3.试验结果分析：

按照试验方法对20例酶免法定值血清样本进行检测，分析2种方法的差异。

4.试验结果：

表4.tni检测结果对比

如表4所示，使用带结合垫的试剂盒和本发明试剂盒同时检测20例tni血清样本，其中带结合垫的试剂条在测试tni血清样本时，个别样本的精密度cv值≧10％，相对偏差≧10％，而本专利试剂盒在0.01-15ng/ml检测范围内均未出现精密度cv≧10％，相对偏差≧10％的情况，表明本专利试剂盒性能良好，满足临床检测tni的需要。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。