磺胺二甲嘧啶快速检测方法与流程

本发明涉及生物快速检测领域，尤其涉及一种磺胺二甲嘧啶快速检测方法。

背景技术：

兽药残留是指动物产品的任何可食用部分所含兽药的母体化合物及(或)其代谢物，以及与兽药有关的杂质。其中包括抗生素类、驱肠虫药类、抗原虫药类、灭锥虫药类等。

残留在动物源性食品中的兽药及饲料添加剂,随着食品链进入人体,对人类的健康构成潜在的威胁,这种威胁已越来越引起人们的重视。随着人们对动物源食品需求的转变，国际上对动物源性食品的药残要求越来越高，动物源食品中的药残已逐渐成为全世界关注的一个焦点，其中抗生素类残留受到了极大的关注。大量、频繁地使用抗生素，可使动物机体中的耐药致病菌很容易感染人类；而且抗生素药物残留可使人体中细菌产生耐药性，扰乱人体微生态而产生各种毒副作用。残留在动物性食品中的兽药及添加剂,随着食品链进入人体,对人类的健康构成潜在的威胁,这种威胁已越来越引起人们的重视。因此，对抗生素进行简单、快速、便捷的现场痕量检测能够对药物的有效监管、保证公众生命健康和保护环境起到关键的作用。

动物组织和尿液中磺胺类抗生素的检测方法主要有高效液相色普法、液质联用法、酶联免疫法等。色谱和质谱法普遍存在前处理过程时间长、操作复杂且操作技术性强、仪器设备昂贵等缺陷，难以满足对现场大量样本的快速筛查要求。酶联免疫法样本量大、成本低廉、仪器简单便携，但酶联免疫法影响因素较多，灵敏性和稳定性有待提高。在保证检测的精密度的同时要提高检测人员的工作效率，研究出一种快速、简便、实时、准确的检测方法有着十分重要的意义。

技术实现要素：

针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种表面增强拉曼光谱技术快速分析动物体内中的磺胺二甲嘧啶，采用银胶作为增强基底，提出一种对磺胺二甲嘧啶的表面增强拉曼光谱定性定量分析方法。

为实现上述目的，本发明提供一种磺胺二甲嘧啶的快速检测方法，采用表面增强拉曼光谱对样品进行快速分析检测，包括以下步骤：

s1：拉曼增强基底液的制备；

s2:标准样品的制备；

s3：样品的快速检测；

s4：数据结果分析。

作为优选，在步骤s1中，制备银纳米增强基底液，将柠檬三钠加入到沸腾的硝酸银溶液中，搅拌后得到银溶胶。

作为优选，将20ml硝酸银溶液溶解于100ml超纯水中进行加热，待沸腾后加入质量浓度为0.01g/ml的柠檬酸钠1.85ml，加热并持续搅拌，待溶液颜色由透明变成淡棕色最后到灰绿色后进行冷却保存，使用时配合1％的氯化钠溶液进行混合使用。

作为优选，在步骤s2中，包括以下分步骤：

s21：将磺胺二甲嘧啶标准品进行溶解，然后逐步稀释成具有一定梯度浓度的溶液；

s22:将动物尿液的阴性样本进行处理，然后添加s21得到的磺胺二甲嘧啶溶液，得到阳性样本；

s23:在阳性样本中加入提取剂进行提取，采用拉曼光谱仪进行检测。

作为优选，在步骤s21中，称取磺胺二甲嘧啶标准品，采用有机溶剂进行溶解后放入棕色容量瓶中，再采用相同的有机溶剂逐步稀释成标准工作液，4℃保存备用；有机溶剂为甲醇、乙醇或乙二醇中的一种。

作为优选，在步骤s22中，取动物尿液阴性样本于离心管中，进行高速离心除去沉淀，取上层清液加入标准工作液配成阳性样本。

作为优选，在步骤s23中，取阳性样本添加乙酸乙酯或乙腈作为提取剂，涡旋静置后进行氮吹，然后再添加对应的提取剂定容，进行检测。

作为优选，在步骤s1之前，还需要对磺胺二甲嘧啶进行数据模拟计算，计算其理论拉曼谱峰，从而确定该标准品的定性谱峰。

作为优选，在步骤s3中，采用表面拉曼仪进行检测时，采用参数为：波数范围400至2000cm-1，激光波长785nm，功率400mw，分辨率2cm-1，积分时间10s。

作为优选，在进行上机检测时，进样瓶中依次添加500μl的银胶、40μl待测液、100μl氯化钠溶液，摇匀后在5s内上仪器采集拉曼信号。

本发明的有益效果是：本申请采用对动物排泄物中磺胺类抗生素表面增强拉曼光谱快速检测方法进行了初步探究。运用密度泛函理论，确定了磺胺二甲嘧啶拉曼特征峰。以拉曼峰强度高且峰型好的特征峰强度建立定量分析曲线。加标回收率实验表明此方法的准确度和精确度较好。该方法检测的最低浓度分别为磺胺二甲嘧啶最低检测浓度为2mg/l本方法定性定量分析猪尿中磺胺类抗生素残留，单个样本检测在2min内完成，检测速度快。

附图说明

图1为本发明的磺胺二甲嘧啶实验光谱图；

图2为本发明的磺胺二甲嘧啶表面增强拉曼光谱；

图3为磺胺二甲嘧啶标准溶液浓度光谱；

图4为磺胺二甲嘧啶定量分析曲线。

具体实施方式

为了更清楚地表述本发明，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步地描述。

表面增强拉曼光谱技术是指将金、银纳米颗粒作为载体，当待测分子吸附到粗糙的金、银表面后，会大幅度增大光与分子的作用表面积，同时金属表面电磁场也会大幅度增强，得到的拉曼信号强度是普通的10⁶倍以上。表面增强拉曼光谱技术具有实验样品前处理简单、单个样本检测速度快、检测灵敏度高等优点，因此在食品农产品中痕量农药残留、抗生素药物残留等质量安全问题的快速监测中得到广泛应用相较于现有技术的情况。

首先对纳米银胶进行制备，准确称取0.100g柠檬酸三钠固体，用去离子水在烧杯中溶解后转移至10ml容量瓶中，定容至刻度线，即得到浓度为0.01g/ml柠檬酸三钠溶液；量取20.00ml硝酸银溶液于100ml超纯水中进行迅速加热，在1分钟内滴加0.01g/ml柠檬酸三钠溶液，以500r/min的转速进行搅拌，待溶液由透明变淡棕色最后变成灰绿色后停止加热，冷却到室温后得到纳米银胶，即银纳米增强基底液。

准确称取氯化钠固体0.5g，用去离子水在烧杯中溶解后转移至50ml容量瓶中，定容至刻度线，即得到1％的氯化钠溶液；检测时，进样瓶中按顺序依次分别加入500μl的银胶、40μl待测液、100μl氯化钠溶液，摇匀后采集拉曼信号。采集参数：波数范围400至2000cm-1，激光波长785nm，功率400mw，分辨率2cm^-1，积分时间10s。在进行样品添加时，移液枪在量取样品时，需要将样品伸入至银胶液面以下，氯化钠溶液滴加至银胶液面以上，摇匀后在5s内上机检测，从而在有效增强表面拉曼的同时保证不会由于氯化银的沉淀对检测造成影响，检测完成后，生成的沉淀物对样品进行包裹，处理时更加方便。采集的数据用matlab-r2012b进行规划处理。

称取0.0100g磺胺二甲嘧啶标准品，用甲醇在烧杯中溶解后转移至100ml棕色容量瓶，得到100mg/l的标准溶液，然后用甲醇逐步稀释成浓度为20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1mg/l的标准工作液，4℃保存备用；取猪尿或者牛尿阴性样本100ml于离心管中，以4500r/min离心5min，除去沉淀，取上层清液5ml,配制成含有磺胺二甲嘧啶的浓度分别为20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1mg/l的猪尿样本，4℃保存备用。

由于磺胺类抗生素几乎不溶于水，能溶于有机溶剂，猪尿或者牛尿中除去大部分水主要成分为尿素、尿酸、马尿酸以及电解质，多属于水溶性的物质，因此采用有机溶剂进行提取，本申请采用乙酸乙酯作为提取剂进行萃取和提取；更为具体的是，取猪尿或者牛尿样本1ml，加入3ml乙酸乙酯，涡旋提取2min，静置分层，取上层乙酸乙酯层于40℃下氮吹至干，用乙酸乙酯溶解定容至1ml，上机检测；本申请中采用乙酸乙酯一方面能有效对磺胺类抗生素进行溶液，还利用乙酸乙酯作为酯类特有的气味能有效覆盖动物尿液中的不良气味，使得在检测过程中，检测人员获得更舒适的感官体验。

在进行相关的检测前，需要对相应的磺胺二甲嘧啶进行理论光谱计算，采用相关的软件构建磺胺二甲嘧啶分子模型，根据密度泛函理论，使用b3lyp方法，用相关软件进行结构优化并且计算其理论拉曼谱峰。

用gaussview5.0软件构建磺胺二甲嘧啶分子模型(磺胺二甲嘧啶，化学式为c12h14n4o2s，主要由苯环,嘧啶基,磺酰胺基等组成)，根据密度泛函理论(dft)，使用b3lyp方法，用guassian09w软件进行结构优化并计算其理论拉曼谱峰。如图1所示，(a)为磺胺二甲嘧啶实验光谱，(b)为其理论计算光谱。在400～1800cm^-1范围内，1587、1531、819和662cm^-1处实验光谱与理论光谱略有偏差但基本吻合,理论计算的主要拉曼谱峰1456和756cm^-1等在实验光谱中未见出峰，而在实验光谱的主要拉曼谱峰1004和580cm^-1等在理论计算中未出现。主要原因是待测分子与溶剂体系之间存在分子作用力，导致增强基底对不同基团的增强效果不同，从而影响分子基团的位移偏移，而理论模拟计算只针对单个分子进行理想计算，不受到分子间作用力的影响。对比发现其主要特征峰的谱峰归属分别为1531cm^-1(1541cm^-1)处表征嘧啶环伸缩振动，819cm^-1(832cm^-1)处表征对位二取代苯环呼吸振动，662cm^-1(670cm^-1)处表征对位二取代苯环变形振动等。

下表为对磺胺二甲嘧啶主要谱峰的归属

图2中(a)是浓度为25mg/l磺胺二甲嘧啶标准溶液表面增强拉曼光谱，(b)为乙酸乙酯的表面增强拉曼光谱，(c)为经过2.7中方法前处理的阴性猪尿样本表面增强拉曼光谱，(d)为银纳米增强基底拉曼光谱。从图2(d)可看出，银纳米增强基底无拉曼峰，说明所用的银溶胶不会对目标的溶液拉曼信号产生影响；对比图2(a)、(b)和(c)可看出，1000cm^-1～1600cm^-1范围内磺胺二甲嘧啶谱峰与乙酸乙酯和阴性猪尿样本的谱峰本发生部分重叠，所以将磺胺二甲嘧啶标准溶液表面增强拉曼光谱中的552、580和662cm^-1处的峰作为磺胺二甲嘧啶的定性谱峰。

配置的磺胺二甲嘧啶标准溶液稀释成梯度浓度为5、2、1、0.5、0.4、0.3mg/l的标准工作液，上机检测后采集的表面增强拉曼光谱如图3所示，a～f浓度分别为5、2、1、0.5、0.4、0.3mg/l。由图3观察可，浓度为0.4mg/l时662cm^-1处的谱峰还可分辨，浓度至0.3mg/l时已经无法分辨，所以磺胺二甲嘧啶标准溶液的最低检出浓度为0.4mg/l。

将配制的含有磺胺二甲嘧啶抗生素梯度浓度为20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1mg/l的的猪尿样本进行前处理，上机检测，采集表面增强拉曼光谱。磺胺二甲嘧啶标准溶液浓度为最低检测浓度时还可分辨的662cm^-1处的峰强与浓度建立定量分析曲线，如图4所示，在2～20mg/l范围内，线性方程为y＝0.0047x-0.0758,相关系数r²＝0.9915,最低检测浓度为2mg/l。向猪尿中添加磺胺二甲嘧啶标准溶液，配制成浓度为5、11、17mg/l的猪尿样本，每个浓度配置3个平行样本，以此来检测本方法的准确度和精密度。样本平均回收率在95.93％～104.16％之间，相对标准偏差在1.18％～7.79％之间。另配制6个含有磺胺二甲嘧啶的未知浓度猪尿样本，进行前处理后，采集3次拉曼信号求平均之后对数据进行规划处理，将计算结果与高效液相色谱的化学检测方法结果进行对比,相对误差在1.16％～6.34％之间。

本发明的优势在于，建立了磺胺二甲嘧啶的标准曲线以及线性回归方程，在实际测量过程中，只需测量样品中的相关值就能计算得到磺胺二甲嘧啶的具体含量，大大提高了检测效率。