一种亚纳米光学检测系统及其检测方法与流程

本发明涉及单分子力谱性质测量技术领域，具体涉及一种亚纳米光学检测系统及其检测方法。

背景技术：

单分子运动研究和力谱技术已广泛用于研究生物学过程，例如rna翻译，转录，分子马达运动，蛋白质-dna互作、重组。此类实验一般依赖于单分子探针的使用。例如dna，rna或蛋白质被连接在磁珠上，然后通过磁珠的运动来获取被测生物分子状态变化的信息。在众多单分子测量方法中，光镊，磁镊和原子力显微镜(afm)是广泛使用的技术。近期一个世界性的技术难点在于测量精度的提升，需要达到纳米乃至亚纳米(埃)的精度。

与光镊和afm相比，磁镊特异性强，无需预热，实验效率和力稳定性高，具有独特的优势。磁性镊子不仅无需执行反馈控制，还具有出色的力稳定性，可以长时间进行实验而不会发生力漂移。此外，可以使用参考磁珠消除任何干扰分子延伸测量的机械漂移。这些特性使磁镊成为了在生理状态下长时间研究生物分子(蛋白、dna等)的力响应与机械性能的一项强大技术。

目前，超高精度显微技术依赖衍射环成像。提高衍射环数量及质量的通用方法是购买成套的显微镜进行成像，此种方法不仅价格高昂、系统改装的灵活性差，因此，研究一个低成本、高精度、易于组装、改装及维护的光学检测系统具有十分重要的意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供一种亚纳米光学检测系统及其检测方法，使用数个光学器件以及支撑件进行组装的光学系统，提高单分子装置微珠的衍射环的清晰度和数量，进而提高测量精度，达到亚纳米精度，应用于磁镊设备的光路系统，能够呈现高质量的图像。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种亚纳米光学检测系统，包括：控制单元、样品池、光输送单元和成像单元；

所述控制单元包括永磁铁和电机，所述电机带动永磁铁旋转及移动；

所述样品池用于盛放单分子样品，单分子样品溶液置于环境溶液中并形成样品腔，单分子样品一端连接有样品池的盖玻片，另一端连接有磁珠；

所述光输送单元包括光源、弯头光纤、光处理单元和物镜，所述光处理单元包括准直器和分束器；

所述光源的光束经过弯头光纤后射入准直器，准直器将射入的光转变为平行光后射入分束器，分束器将射入的平行光分为光强相同的反射光与折射光，形成全反射光路，反射光竖直照射样品池上，使单分子样品的磁珠形成多个衍射环；

所述成像单元包括研究级相机和计算模块，所述研究级相机采集单分子样品的磁珠图像，并传输至计算模块，所述计算模块将研究级相机采集的磁珠图像转化为二维光强分布，转化为磁珠的实时三维位置，得出被测磁珠的z轴数值。

作为优选的技术方案，所述永磁铁还连接有承载零件，所述承载零件另一端连接有支撑杆，所述电机包括第一电机与第二电机，所述第一电机控制支撑杆沿中心轴旋转，所述第二电机控制支撑杆沿样品池竖直方向移动。

作为优选的技术方案，所述单分子样品的一端与样品池的盖玻片化学连接，另一端与磁珠化学连接。

作为优选的技术方案，所述光源采用环形led光纤照明器。

作为优选的技术方案，所述弯头光纤的光纤口径设置0.5cm以上。

作为优选的技术方案，所述分束器采用50/50分束器。

作为优选的技术方案，所述物镜的位置采用准焦螺旋进行粗调，压电陶瓷进行微调，所述物镜采用放大倍数为100的油镜。

作为优选的技术方案，所述光输送单元与研究级相机之间采用t型管进行排列及固定。

本发明还提供一种根据权利要求1-8所述亚纳米光学检测系统的检测方法，包括下述步骤：

将研究级相机采集的磁珠实时图像转化为二维光强分布，即图像中每一个像素点的光强数值，然后再将光强数值转化为磁珠的实时三维位置；

对被测磁珠不同的z轴位置建参考库，将实时采集的图像与参考库中的磁珠图像进行对比，选出一个与当前被测磁珠图像最相近的图像，得出其关联的z位置，输出被测磁珠的z轴数值。

作为优选的技术方案，所述对被测磁珠不同的z轴位置建参考库，具体步骤包括：采用固定步长移动物镜，采集不同z轴位置上被测磁珠的图像。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明所采集得到的磁珠图像具有十分连续的光环与数量众多的衍射环，这些完整、清晰的环形图案对提高磁镊装置的精度起到重要的作用。

(2)本发明的光学器件小巧轻便、灵活度很高，可以组装在任意磁镊系统上而不会改变其他结构、影响其他功能，并且可以采用多种方式进行组装与固定，易于更换与检修。

(3)本发明所采用的大口径弯头光纤相较于同种类光纤，其最大优点是采用45°输入接头，无论输出接头竖直或水平，都能使得光纤的弯曲损耗减少，使光在运输过程的损耗大大减少，并易于安装连接。

(4)本发明所采用的光源在设计时考虑了显微镜应用，能够支持并完全照亮环形光纤，适合进行单分子实验；其次，还拥有低放热、低功率、低排放的优点及支持多种电源和光纤的强大通用性。

(5)本发明采用了t型管作为支撑、数个光学器件为核心组装成一个成像系统，解决了以往磁镊系统过于依赖昂贵的研究级显微镜作为成像单元、成像精度不高导致后续的数据误差过大的技术问题，达到了实现亚纳米级别精度的成像效果。

附图说明

图1为本实施例的亚纳米光学检测系统的结构示意图；

图2为本实施例大口径弯头光纤的结构示意图；

图3为本实施例磁珠实时图像及转化后的二维光强数组；

图4为本实施例磁珠部分实时z坐标。

1-永磁铁、2-样品池、3-物镜、4-50/50分束器、5-研究级相机、6-准直器、7-大口径弯头光纤、8-光源、9-大口径输入端口、10-光纤主体、11-输出端口。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

如图1所示，本实施例提供一种亚纳米光学检测系统，包括：控制单元、样品池2、光输送单元和成像单元，光输送单元将光源发出的光经过处理后投送到样品上，成像单元用于采集并分析样品中磁珠的图像数据；

控制单元包括永磁铁1与电机，通过电机带动永磁铁旋转，改变永磁铁的位置及旋转，以此改变磁珠所受的竖直方向上的力及水平方向上的力矩；

在本实施例中，永磁铁优选的设置方式为：穿过样品的磁力线在水平方向。磁铁改变距离，样品受力变化；磁场旋转，样品受力矩作用。本实施例设计一种承载零件，该承载零件能承载块状与片状的小磁铁，底部设有能和支撑杆固定的凹槽。该支撑杆由两个不同的电机控制，其中一个控制磁铁的竖直位置，另一个控制支撑杆的旋转，此旋转是沿支撑杆的中心轴旋转，磁极方向不断变化，这两个电机均由计算机控制。

样品池用于盛放单分子样品；其中，单分子样品溶液置于环境溶液中并形成一个样品腔，单分子样品通过化学连接一端连接在样品池的盖玻片上，另一端连接在磁珠上。

本实施例的化学连接是通过在样品腔的上下任意一端孵育上一层特殊的化学物质，磁珠表面也孵育上一层不同的化学物质，这些化学物质能和研究物质的两端进行特异性结合，形成一个样品腔一端——研究分子——磁珠的整体。由于样品腔在实验的过程中几乎可以被视为不动的，所以可以通过控制磁珠的受力来控制研究分子的受力。

例如：若要研究csga纤维，则使用氨基官能化的磁珠和纤维的一端结合，通过磁珠上的氨基和纤维的羧基进行共价反应形成一个整体；纤维的另一端和样品腔的底部进行schiff碱反应，完成连接。

光输送单元包括光源8、大口径弯头光纤7、光处理单元和物镜3，其中，大口径弯头光纤的光纤口径0.5cm以上，光处理单元将输入光优化为平行光并输出，光处理单元包括准直器6和50/50分束器4；

准直器6包括光圈和透镜，将射入的光转变为平行光并输出，使光在运动方向在特定方向上变得更加对齐，或者使光束的空间横截面变得更均匀；

50/50分束器4将射入的光一分为二为光强相同的反射光与折射光，形成全反射光路，实现同轴照明，将50/50分束器4设置为与水平面形成45°角，使得反射的光竖直打在样品池2上，使单分子样品的磁珠形成多个衍射环。

本实施例的物镜采用放大倍数为100的油镜，物镜是为了将单分子样品的图像进行放大至其可以被肉眼观察与数据分析。

光源作为磁镊装置的光提供者，本实施例的光源采用环形led光纤照明器，环形led光纤照明器在设计时考虑了显微镜应用，光照高度均匀，能反映出样品的细微差别。此环形led光纤照明器拥有低发热量、低耗电量、低碳足迹等优点，能够支持并完全照亮环形光纤，适合进行单分子实验，本实施例优选环形大功率led光源或卤素灯。

如图2所示，大口径弯头光纤7将光从光源输送到光处理单元，大口径弯头光纤7由以下部分构成：大口径输入端口9，连接光源，作为环形led光纤照明器的输入口；光纤主体10，作为光输送的载体；输出端口11，即大口径弯头光纤的末端，设有一个聚光镜片，连接光处理单元的准直器6；

本实施例的光纤直径大，单光束有很高的亮度。光纤由高硬度不锈钢包裹，保障机械稳定性。

本实施例成像单元包括研究级相机5和计算机(或嵌入计算机的计算模块)，研究级相机固定在样品池2正上方，置于被光输送单元照亮的样品之上，在单分子实验时实时采集图像，并输送到计算机进行图像处理，以此记录单分子样品的运动情况；

研究级相机有以下特点：

传感器的类型为cmos；每个像素的大小为7微米左右的正方形；视频采集帧率为每秒500帧；采集颜色可选为rgb模式与灰度模式。

本实施例的亚纳米光学检测方法具体包括：

本实施例的计算机将研究级相机采集的磁珠实时图像转化为二维光强分布，即图像中每一个像素点的光强数值，然后再将光强数值转化为磁珠的实时三维位置；

先对被测磁珠不同的z轴位置建参考库，建库的过程为：通过固定步长移动物镜，采集不同z轴位置上被测磁珠的图像。这样就形成了一个磁珠图像——z轴位置一一对应的库。在实验的过程中，实时采集的图像会被拿去和库中的磁珠图像对比，计算机会选出一个与当前被测磁珠图像最相近的图像，进而得出其关联的z位置。

通过控制磁铁距离样品腔的位置及旋转，使得磁珠受到不同的磁力，此力会传达到所测分子上引起分子的长度变化，z轴数值即反映出所测分子在实验过程中的长度变化。

当成像系统效果较差时，磁珠所产生的光环可能过粗、过细、过暗或不连续，导致不同位置的磁珠图像之间辨识度不高，所建的参考库不能和z轴位置形成一一对应的关系，最终在实验时一个磁珠在一个固定位置不变时，计算机却判定出多个z值，导致误差产生。

每次计算时需要选取两个珠子，一个是表面上没有孵育任何物质，即不与实验分子所连接的、粘在流动腔的参考珠子，另一个则是和实验分子、流动腔形成一个整体的实验珠。在实验时，实验珠的实时z值减去参考珠的实时z值获得最终的z值，这样消除了环境的噪声、震动等干扰源对所有珠子产生的z方向上的震动，达到了增加实验精度的目的。

如图3和图4所示，计算机基于labview编程，将研究级相机所采集的磁珠实时图像转化为二维光强数组，然后将二维光强数组转化为具体的三维位置数值，选择z轴数值输出至显示图表上，形成一张磁珠z轴位置比时间的图，如图4所示，横坐标表示采集点数目，左侧纵坐标表示磁珠实时z轴位置，单位为微米，以此来实时观察单分子样品的形态变化，由图可知，本实施例的亚纳米光学检测系统使磁镊装置的测量精度达到小于1纳米的水平。

具体地，将二维光强分布在x、y坐标轴方向上的径向光强分布与其镜像分布做互相关运算，以获得并校准磁球在平面坐标轴上的坐标值；然后通过不同的z轴数值对应的磁珠图像建立参考库，再将被测磁珠的图像与参考库进行对比，最后得出被测磁珠的z轴数值，最小单位可达0.5纳米。

在本实施例中，光输送单元中的光学元件与研究级相机通过t型管进行排列、固定，t型管即为带有螺纹的套管，这些套管规格各不相同，可以通过螺纹来相互连接、固定光学器件，以此来构造所需的光学系统。

在本实施例中，控制单元的电机与物镜的位置通过计算机进行控制，磁铁电机与计算机连接，计算机通过控制电机的运行调整磁铁的位置，进而调节磁珠所受的磁力大小和方向。

在本实施例中，物镜的位置是通过准焦螺旋进行粗调，压电陶瓷进行微调。压电陶瓷的精度为数十纳米，建立参考库的步长为数百纳米，并由计算机控制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。