基于纳米等离子共振的新型冠状病毒颗粒定量检测方法与流程

本发明涉及涉及检测技术领域，具体涉及一种基于纳米等离子共振的新型冠状病毒颗粒定量检测方法。

背景技术：

分子相互作用动力学的测量在药物发现，遗传筛查和临床诊断中越来越重要，因为动态结合信息可以提高对疾病的认识和可以为治疗提供新思路。表面等离子体共振(spr)传感器，如商业biacorespr生物传感器系统，能够实时监测动力学生物分子相互作用，无需标记，不受大量背景的影响。由于商业biacorespr生物传感器系统属于传统spr设备，所以其需要特制的设备，专人的操作，使得购买或使用该生物传感器系统需要大量的金钱。

新型冠状病毒是截止目前为止，发现的第七种可以感染人类的冠状病毒。是一种单股正链rna病毒，长度约30kb，属于基因组最大的rna病毒之一。新型冠状病毒的突刺糖蛋白s-蛋白，能和人的呼吸道上皮细胞以及肺组织细胞的血管紧张素转化酶2(ace2)结合，从而进入细胞，以自身rna链为翻译模板，表达出病毒rna聚合酶。再进行一系列转录合成、各种结构蛋白mrna的合成和复制，组装成新的冠状病毒分泌至细胞外。目前，仍没有特效抗病毒的药物来治疗新型冠状病毒，需要患者激发自身免疫力来对抗病毒。现今已开发的sars-cov-2病毒核酸检测试剂盒存在周期长，对检测人员和环境要求高，检测精准度低，需复核等限制，而针对sars-cov-2病毒的蛋白检测试剂盒也存在检测灵敏度不高的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在上述缺陷，提供一种基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒(sars-cov-2)的定量检测方法，来解决商业biacorespr生物传感器系统检测成本较高的问题以及改良病毒颗粒检测检方式。

根据本发明，提供了一种，基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法，包括：

第一步骤：制备孔板以及纳米等离子共振传感芯片，将纳米等离子共振传感芯片布置在孔板的孔中以制备等离光子谐振耦合效应设备；

第二步骤：制备用于放大检测信号的纳米金颗粒；

第三步骤：在纳米等离子共振传感芯片表面修饰sars-cov-2捕获抗体，用来特异性检测sars-cov-2病毒颗粒的滴度；

第四步骤：用sars-cov-2标记抗体标记纳米金颗粒；

第五步骤：向标记好的纳米金颗粒中加入不同滴度的sars-cov-2病毒颗粒样品，制备成混合溶液；

第六步骤：向待测孔板中加入混合溶液，完成sars-cov-2病毒颗粒与标记纳米金颗粒复合物的捕获；

第七步骤：通过检测加样前后在特定波长下的吸光度差值随时间的变化曲线，实现sars-cov-2病毒颗粒定量检测。

优选地，特定波长为580nm波长、605nm波长、620nm波长、640nm波长中的一个或多个。

优选地，纳米金颗粒是粒径为15～80nm的纳米金颗粒，优选粒径为20-70nm的纳米金颗粒。

优选地，制备用于放大检测信号的纳米金颗粒的方法包括：在去离子水中加入氯金酸溶液，加热至沸腾后再加入柠檬酸三钠溶液，继续加热并采用磁力搅拌器进行搅拌，溶液颜色会由黑色变至橙红色，待溶液颜色恒定，再加热预定时间后停止加热，随后静置溶液冷却至室温，以得到au纳米颗粒分散溶液，作为纳米金颗粒。

优选地，在纳米等离子共振芯片表面修饰sars-cov-2捕获抗体的方法包括：在室温条件下将纳米等离子共振芯片置于11-巯基十一烷酸溶液中，用乙醇清洗后以氮气吹干；加入400×10-3m1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和100×10-3mn-羟基丁二酰亚胺的1:1混合液中孵育；孵育结束后放入单克隆抗sars-cov-2捕获抗体内于室温孵育，随后清洗后用吹干；加入牛血清白蛋白阻断液中室温孵育，去除牛血清白蛋白阻断液并加入乙醇胺溶液室温孵育，以覆盖未反应的nhs酯；随后用去离子水清洗后氮气吹干后放置于干燥环境中。

优选地，用sars-cov-2标记抗体标记纳米金颗粒的方法包括：用k2co3溶液调节纳米金颗粒溶液ph至sars-cov-2标记抗体或ace2蛋白的等电点，加入sars-cov-2标记抗体或ace2蛋白抗体，混匀后在室温孵育，然后加入终浓度为0.5-1.5％的牛血清白蛋白阻断液，在室温孵育；设置离心机转速为5000-9000rpm/min，离心25分钟，去除上清，用去离子水复溶。

优选地，sars-cov-2病毒颗粒与标记纳米金颗粒复合物的捕获包括：将sars-cov-2病毒颗粒加入到sars-cov-2病毒s-蛋白抗体或ace2蛋白标记过的纳米金颗粒复溶液中，混匀后将混合物加入到覆盖了sars-cov-2捕获抗体或蛋白的芯片孔板中，再将孔板放入酶标仪中震荡反应。

优选地，通过检测加样前后在特定波长下的吸光度差值随时间的变化曲线包括：加样前，取出覆盖了sars-cov-2捕获抗体或蛋白的芯片孔板，在待测试孔中加入100μl去离子水，用酶标仪检测待测试孔在特定波长下的第一吸光度值。待孔中加入样品混合液并且反应完毕后，吸去样品混合液，并用去离子水清洗测试孔，再向测试孔中加入100μl去离子水，检测测试孔在特定波长下的第二吸光度值。

优选地，sars-cov-2捕获抗体是捕获sars-cov-2病毒的s蛋白抗体和ace2蛋白中的一种，sars-cov-2标记抗体是sars-cov-2病毒的s蛋白抗体和ace2蛋白中的另一种。

本发明的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒(sars-cov-2)的定量检测方法，能够解决商业biacorespr生物传感器系统检测成本较高的问题，并且能够改良病毒颗粒检测检方式。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的步骤流程图。

图2示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的示意图。

图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的原理示意图。

图4和图5为本发明实施例提供的特定折光率样品光谱示意图。

图6为本发明实施例提供的检测不同浓度的新型冠状病毒颗粒(sars-cov-2)的吸光度差值结果图。

需要说明的是，本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

具体实施方式

为了使本发明的内容更加清楚和易懂，下面结合具体实施例和附图对本发明的内容进行详细描述。

图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的步骤流程图，图2示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的示意图，图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法的原理示意图。

如图1、图2和图3所示，根据本发明优选实施例的基于纳米等离子共振传感芯片的新型冠状病毒颗粒的定量检测方法包括：

第一步骤s1：制备孔板以及纳米等离子共振传感芯片，将纳米等离子共振传感芯片布置在孔板的孔中以制备等离光子谐振耦合效应设备；

例如，孔板是96孔板。

第二步骤s2：制备用于放大检测信号的纳米金颗粒；例如，纳米金颗粒是粒径为15～80nm的纳米金颗粒，优选粒径为20-70nm的纳米金颗粒。

具体地，例如，制备用于放大检测信号的纳米金颗粒的方法包括：在例如100ml去离子水中加入例如1ml1％氯金酸溶液，加热至沸腾，然后再加入例如0.6-4ml1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热并采用磁力搅拌器进行搅拌，溶液颜色会由黑色变至橙红色，待溶液颜色恒定，再加热例如15分钟后停止加热。随后静置冷却至室温，即可得到澄清透亮的au纳米颗粒分散溶液，即最终的纳米金颗粒。

第三步骤s3：在纳米等离子共振传感芯片表面修饰sars-cov-2捕获抗体，用来特异性检测sars-cov-2病毒颗粒的滴度；具体地，sars-cov-2捕获抗体是捕获sars-cov-2病毒的s蛋白抗体或ace2蛋白。

例如，在纳米等离子共振芯片表面修饰sars-cov-2捕获抗体的方法包括：在室温条件下将纳米等离子共振芯片置于1-10mm11-巯基十一烷酸溶液中1-12小时，用70％乙醇清洗后以氮气吹干；加入400×10-3m1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和100×10-3mn-羟基丁二酰亚胺的1:1混合液中孵育30-60分钟；孵育结束后立即放入50μg/ml单克隆抗sars-cov-2捕获抗体内于室温孵育3-5小时，pbs清洗两次后用氮气吹干；加入0.5-1.5％牛血清白蛋白阻断液中室温孵育20-60分钟，去除牛血清白蛋白阻断液并加入10％乙醇胺溶液室温孵育30-60分钟，以覆盖未反应的nhs酯；去离子水清洗后两次后，氮气吹干后放置于干燥环境中。

第四步骤s4：用sars-cov-2标记抗体标记纳米金颗粒；具体地，sars-cov-2标记抗体是sars-cov-2病毒的s蛋白抗体或ace2蛋白。需要说明的是，在实际实施时，例如，sars-cov-2捕获抗体与标记抗体可以互换。

例如，用sars-cov-2标记抗体标记纳米金颗粒的方法包括：用0.1mk2co3溶液调节纳米金颗粒溶液ph至sars-cov-2标记抗体或ace2蛋白的等电点，加入适量的sars-cov-2标记抗体或ace2蛋白抗体，混匀，室温孵育30分钟，然后加入终浓度为0.5-1.5％的牛血清白蛋白阻断液，室温孵育10分钟。设置离心机转速为5000-9000rpm/min，离心25分钟，去除上清，用适量去离子水复溶，例如复溶至原溶液体积的1/4。

第五步骤s5：向标记好的纳米金颗粒中加入不同滴度的sars-cov-2病毒颗粒样品，制备成混合溶液；当然，该步骤包括配制不同滴度的sars-cov-2病毒颗粒标准品溶液，用于测量样品中的sars-cov-2病毒颗粒滴度；例如，配制不同滴度范围的新型冠状病毒颗粒(sars-cov-2)标准样品(1*10³vp/ml～1*10¹⁰vp/ml)；稀释底液为pbs缓冲液。

第六步骤s6：向待测孔板中加入混合溶液，完成sars-cov-2病毒颗粒与标记纳米金颗粒复合物的捕获；

具体地，例如，sars-cov-2病毒s-蛋白抗体或ace2蛋白与标记过的纳米金颗粒复合物的捕获方法包括：将sars-cov-2病毒颗粒加入到sars-cov-2病毒s-蛋白抗体或ace2蛋白标记过的纳米金颗粒复溶液中，混匀后，将混合物加入到覆盖了sars-cov-2捕获抗体或蛋白的芯片孔板中，再将孔板放入酶标仪中震荡反应5-30分钟。

第七步骤s7：通过检测加样前后在特定波长下的吸光度差值随时间的变化曲线，实现sars-cov-2病毒颗粒定量检测。

例如，特定波长为580nm波长、605nm波长、620nm波长、640nm波长中的一个或多个。

具体地，加样前，取出覆盖了sars-cov-2捕获抗体或蛋白的芯片孔板，在待测试孔中加入100μl去离子水，用酶标仪检测待测试孔在特定波长下的第一吸光度值。待孔中加入样品混合液并且反应完毕后，吸去样品混合液，并用去离子水清洗测试孔(2次)，再向测试孔中加入100μl去离子水，检测测试孔在特定波长下的第二吸光度值。

或者，加样前，取出覆盖了sars-cov-2捕获抗体或蛋白的芯片孔板，在待测试孔中加入样品混合液，检测测试孔在特定波长下的吸光度随时间的变化值。

可用加样前后的测试孔吸光度差值来表征sars-cov-2病毒颗粒与sars-cov-2抗体间的接合量，由此实现sars-cov-2病毒颗粒定量检测。

本发明实施例至少具有如下优点：利用普通酶标仪与纳米金颗粒实现病毒颗粒的定量测定，该器件可最大限度减少特殊仪器系统需求。具有选择性好、敏感度高等优点，由于被特定抗体标记后的纳米金颗粒可特异性结合sars-cov-2病毒颗粒表面的s-蛋白，因此能进一步放大检测信号，且无需额外的检测标记物质，简化了检测过程，降低了检测成本；芯片在特定波长(580、605、620、640nm)段透射光强度的改变而对表面折射率的变化有极高的敏感性。

需要说明的是，除非特别指出，否则说明书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等描述仅仅用于区分说明书中的各个组件、元素、步骤等，而不是用于表示各个组件、元素、步骤之间的逻辑关系或者顺序关系等。

可以理解的是，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而上述实施例并非用以限定本发明。对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。