一种用于检测大肠杆菌的试剂盒的制作方法

本发明涉及光谱检测领域，尤其涉及一种用于检测大肠杆菌的试剂盒。

背景技术：

大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病。大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。

目前大肠杆菌的检测方法很多，有发酵法、滤膜法、pcr法、elisa检测法等，但是目前的检测方法一般需要的试剂都比较多，检测精度高的需要的时间较长，而快速检测的精度又比较低。

技术实现要素：

针对上述内容，为解决上述问题提供一种用于检测大肠杆菌的试剂盒，包括试剂a、试剂b、试剂c、试剂d和紫外可见分光光度计；

其中试剂a为利用水热法制备并经过激光二次处理的的纳米金胶体，纳米金胶体的粒径为200-400nm；试剂b为使用激光液相烧蚀法制备的金量子点，金量子点的粒径为20nm以下；试剂c和试剂d为大肠杆菌的两种不同抗体；

其中试剂c可以对试剂a进行表面改性，并将试剂c连接到试剂a的纳米金表面；试剂d可以对试剂b进行表面改性，并将试剂d连接到试剂b的金量子点表面。

试剂c和试剂d分别为igg、igm、iga、ige和igd五类抗体中的一类，且试剂c和试剂d不同。

试剂a的制备方法包括如下步骤：

步骤a1，在200ml去离子水中加入氯金酸溶液5ml，氯金酸溶液的浓度为1mm；然后加入0.1mm的硼氢化钠溶液1ml以及过量的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后缓慢加热，保持液体95-98℃，不要沸腾，使用玻璃棒搅拌1-1.5小时，得到纳米金颗粒；

步骤a2，将步骤a1得到的纳米金颗粒进行10倍稀释，然后将其置于248nm激光下进行脉冲辐照，辐照单脉冲能量大于400mj，重复频率10-50hz，光斑面积2-4cm²；辐照时不断旋转液体改变辐照位置，使得辐照均匀，持续30-90min后离心去除上层清液得到试剂a。

试剂b的制备方法包括如下步骤：

步骤b1，将一块2cm×2cm面积的金靶安装到烧杯底部，然后将烧杯中注入厚度小于1cm的去离子水；使用248nm激光将焦点聚焦在金靶材表面进行烧蚀，激光单脉冲能量300mj以上，重复频率10hz；烧蚀过程中不断移动焦点的位置，使得烧蚀等均匀，持续烧蚀30-60min；

步骤b2，将步骤b1后的溶液进行二次处理，在溶液中加入柠檬酸钠溶液，将光斑扩大至2-4cm²，其他参数不便继续辐照60-90min，然后离心去除上层清液得到试剂b。

试剂盒的使用方法包括如下步骤：

将一定体积的试剂a和试剂c以及去离子水进行混合，其中试剂c已经进行过巯基化处理，混合后加热至40℃，保持30min；得到e溶液

将一定体积的试剂b和试剂d与去离子水混合，其中试剂d已经进行过巯基化处理，混合后加热至40摄氏度，保持30min；得到f溶液

将1体积已知的浓度的含有固定浓度的大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m，540的强度为n；

将1体积的不含大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m0,540的强度为n0；

计算检测因子q0=(m0-m)+(n-n0)；

改变不同浓度的已知大肠杆菌的样品，重复多次测定，得到梯度浓度的大肠杆菌样品的检测因子；绘制表准曲线，其中横坐标为大肠杆菌浓度，纵坐标为检测因子q0；

将1体积未知浓度的大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m2，540的强度为n2；

计算未知样品的检测因子q=(m0-m2)+(n2-n0)；将q代入标准曲线获得大肠杆菌的浓度。

本发明利用表面等离共振原理，由于金纳米颗粒的表面等离共振会受到其表面结构的影响而变化，尤其是表面附着与其同性质的金纳米颗粒时，因此使用两种不同种类的大肠杆菌抗体先将大肠杆菌与量子点进行连接，然后将其整体与纳米金颗粒进行连接，附着在纳米金颗粒表面的不只有大肠杆菌还有纳米金量子点，这使得纳米金颗粒的表面等离子体共振变化更加剧烈，产生了大约30nm的峰位变化，从而使得510nm的强度降低，且540nm附近的峰值增强；将这两种变化进行相加就可以充分对大肠杆菌进行检测。本发明可以将试剂提前准备好，标准曲线绘制好，检测时只需要将试剂混合后保存一定时间然后测定其光吸收即可，简单快速，准确性好。甚至在需要快速检测时可以直接将样品进行混合，省略保存的时间，混合后摇动几下直接检测，也能进行高精度的检测。

本发明将水热法以及烧蚀法制备的纳米结构都进行二次的激光辐照处理，可以最大限度的统一纳米结构的粒径范围，使得光吸收峰更加尖锐，信噪比更高，大大提高了检测的精度。

附图说明

被包括来提供对所公开主题的进一步认识的附图，将被并入此说明书并构成该说明书的一部分。附图也阐明了所公开主题的实现，以及连同详细描述一起用于解释所公开主题的实现原则。没有尝试对所公开主题的基本理解及其多种实践方式展示超过需要的结构细节。

图1为本发明的检测光吸收示意图；

图2为本发明的金颗粒和量子点的结构示意图；

图3为本发明的检测原理；

图4为本发明试剂a（右）和试剂b（左）的扫描电镜图像。

具体实施方式

本发明的优点、特征以及达成所述目的的方法通过附图及后续的详细说明将会明确。

一种用于检测大肠杆菌的试剂盒，包括试剂a、试剂b、试剂c、试剂d和紫外可见分光光度计；

其中试剂a为利用水热法制备并经过激光二次处理的的纳米金胶体，纳米金胶体的粒径为200-400nm；试剂b为使用激光液相烧蚀法制备的金量子点，金量子点的粒径为20nm以下；试剂c和试剂d为大肠杆菌的两种不同抗体；

其中试剂c可以对试剂a进行表面改性，并将试剂c连接到试剂a的纳米金表面；试剂d可以对试剂b进行表面改性，并将试剂d连接到试剂b的金量子点表面。

试剂c和试剂d分别为igg、igm、iga、ige和igd五类抗体中的一类，且试剂c和试剂d不同。

试剂a的制备方法包括如下步骤：

步骤a1，在200ml去离子水中加入氯金酸溶液5ml，氯金酸溶液的浓度为1mm；然后加入0.1mm的硼氢化钠溶液1ml以及过量的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后缓慢加热，保持液体95-98℃，不要沸腾，使用玻璃棒搅拌1-1.5小时，得到纳米金颗粒；

步骤a2，将步骤a1得到的纳米金颗粒进行10倍稀释，然后将其置于248nm激光下进行脉冲辐照，辐照单脉冲能量大于400mj，重复频率10-50hz，光斑面积2-4cm²；辐照时不断旋转液体改变辐照位置，使得辐照均匀，持续30-90min后离心去除上层清液得到试剂a。

试剂b的制备方法包括如下步骤：

步骤b1，将一块2cm×2cm面积的金靶安装到烧杯底部，然后将烧杯中注入厚度小于1cm的去离子水；使用248nm激光将焦点聚焦在金靶材表面进行烧蚀，激光单脉冲能量300mj以上，重复频率10hz；烧蚀过程中不断移动焦点的位置，使得烧蚀等均匀，持续烧蚀30-60min；

步骤b2，将步骤b1后的溶液进行二次处理，在溶液中加入柠檬酸钠溶液，将光斑扩大至2-4cm²，其他参数不便继续辐照60-90min，然后离心去除上层清液得到试剂b。

试剂盒的使用方法包括如下步骤：

将一定体积的试剂a和试剂c以及去离子水进行混合，其中试剂c已经进行过巯基化处理，混合后加热至40℃，保持30min；得到e溶液

将一定体积的试剂b和试剂d与去离子水混合，其中试剂d已经进行过巯基化处理，混合后加热至40摄氏度，保持30min；得到f溶液

将1体积已知的浓度的含有固定浓度的大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m，540的强度为n；

将1体积的不含大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m0,540的强度为n0；

计算检测因子q0=(m0-m)+(n-n0)；

改变不同浓度的已知大肠杆菌的样品，重复多次测定，得到梯度浓度的大肠杆菌样品的检测因子；绘制表准曲线，其中横坐标为大肠杆菌浓度，纵坐标为检测因子q0；

将1体积未知浓度的大肠杆菌样品与1体积f溶液混合，混合后20摄氏度保温30min；然后加入1体积的e溶液，保温30min分钟后测定400-600nm的光吸收强度；510nm的强度为m2，540的强度为n2；

计算未知样品的检测因子q=(m0-m2)+(n2-n0)；将q代入标准曲线获得大肠杆菌的浓度。

基于上述方法和试剂盒实现了对大肠杆菌的检测，值得指出的是，本发明的方法还可以与其他贵金属的纳米颗粒进行，试剂a可为利用水热法制备并经过激光二次处理的的纳米银胶体，纳米银胶体的粒径为200-400nm；试剂b为使用激光液相烧蚀法制备的银量子点，银量子点的粒径为20nm以下；试剂c和试剂d为大肠杆菌的两种不同抗体；

亦或者试剂a可为利用水热法制备并经过激光二次处理的的纳米金胶体，纳米金胶体的粒径为200-400nm；试剂b为使用激光液相烧蚀法制备的银量子点，银量子点的粒径为20nm以下；试剂c和试剂d为大肠杆菌的两种不同抗体；

以上所述，仅为本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。