1.本发明属分析化学的检测领域，具体涉及基于生物分子特异性识别的稳定同位素（metalstableisotope）传感领域，特别设计一种免疫夹心结构，金纳米粒子（aunps）与银纳米粒子（agnps）产生的稳定同位素通过电感耦合等离子体质谱仪分别对蛋白质及其亚型实现同时检测的方法。
背景技术：
：：2.甲胎蛋白（afp）是一种肝癌的疾病标志物，但它的敏感性与早期诊断率偏低。实质上afp是一种糖蛋白，依据与扁豆凝集素（lca）的亲和力，afp被分为三种类型：afp-l1、afp-l2和afp-l3。其体内的来源也存在差异，其中afp-l1主要出现在良性的肝脏疾病中如慢性肝炎和肝硬化。afp-l3只能由癌变的肝细胞产生。临床以afp-l3占总afp的比率，简称甲胎蛋白异质体比率（afp-l3%），2005年美国fda批准afp-l3%≥10%，作为诊断肝癌的临界值，并认为是诊断肝癌的高特异性指标。3.在现在建立的对甲胎蛋白异质体的分析方法中，有已经应用于临床的基于lca亲和的电泳法，传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，但在定量方面具有准确性不足的缺陷。近年来分析化学领域提出的基于表面增强拉曼光谱、电化学的方法，因其操作比传统方法简单、依据的生物原理经典、较好的分析性能和较低的检出限吸引了广泛的研究关注。但在分析方法的准确性、检测信号的稳定性、检测结果的重现性与对血清样本的检测能力方面还需要我们做更多的探索以使对甲胎蛋白异质体比例的检测至臻完善。4.为克服这一制约，本发明结合电感耦合等离子体质谱仪（inductivecoupledplasmamassspectrometry,icpms）检出限低（大部分元素都可以达到pgml-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，将抗体—抗原—纳米粒子标记探针消解后进行稳定同位素检测，在保持优秀的检出限性能同时，实现了对甲胎蛋白与甲胎蛋白异质体的稳定而准确的同时检测，为甲胎蛋白异质体比率的检测提出了一种更稳定可靠的分析方法。技术实现要素：5.本发明提供一种基于稳定同位素检测的纳米粒子标记分析方法，以及其在蛋白质与蛋白质亚型检测方面的应用。6.本发明的原理是：以甲胎蛋白及其亚型甲胎蛋白异质体为例，在甲胎蛋白与其异质体抗原的存在下，抗甲胎蛋白单克隆抗体可以将其捕获，被捕获固定的抗原继而可以与纳米粒子标记的探针结合。当抗体-抗原-纳米粒子标记探针的夹心结构形成后，探针上的金和银纳米粒子通过酸消解后形成离子，可进行icpms定量分析。本发明的目的是通过不同浓度的甲胎蛋白及其异质体产生的金与银元素的同位素强度的变化进行线性回归分析，对甲胎蛋白及其异质体进行稳定同位素检测，进而通过同位素强度的比例的关系获得甲胎蛋白异质体比率数值。7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明所构建的生物传感器的原理是：利用甲胎蛋白与其异质体的作为抗原的相同点与作为糖蛋白的不不同点设计捕获结构与探针结构。将作为抗原捕获结构的鼠抗人抗甲胎蛋白单克隆抗体和磁性微球（mbs）组装在一起，样品甲胎蛋白及其异质体在缓冲溶液中与捕获抗体进行反应，甲胎蛋白及其异质体均发生抗原抗体特异性结合反应，随后加入4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子探针与扁豆凝集素修饰的银纳米粒子探针，二者分别与甲胎蛋白，甲胎蛋白异质体发生多糖与岩藻糖单元的特异性识别，构成捕获抗体—甲胎蛋白—金纳米粒子探针和捕获抗体—甲胎蛋白异质体—银纳米粒子探针的结构。8.对结合的金与银纳米粒子进行酸消解和稳定同位素检测方法为：磁性分离后，用酸对aunps和agnps进行消解，形成的金银离子进行icpms高灵敏检测。选取197au与109ag同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过不同浓度的甲胎蛋白引起的197au以及甲胎蛋白异质体引起的109ag同位素强度值进行线性回归分析，即可对待测甲胎蛋白及其异质体进行定量分析；将所对应的同位素197au与109ag强度作比值即可得到甲胎蛋白异质体比率；其中，甲胎蛋白及其异质体与抗体反应所用溶液和与金银探针反应的缓冲液均为pbs（10mm，ph=7.4），时间分别为60min和45min，温度为37℃。9.本发明有如下有益效果：本发明提供了一种可以对甲胎蛋白异质体比率实现一次性双信号检测的分析方法，可以保持在同一样品同时产生准确的分析信号。本发明利用的抗体—抗原结构具有目标捕获高效稳定的优势；形成的抗原—探针结构具有选择性好，信号强度高的优势，且磁性分离操作简单，可高通量地对多个样品进行快速而准确的双信号同时分析，从而具有对甲胎蛋白异质体比率响应快速的优势，同时利用icpms对稳定同位素检测的检出限低（大部分元素都可以达到pgml-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，在提高对甲胎蛋白异质体检测的灵敏度的同时，减小了样品使用量与缩短了对一种样品内两种物质的分析时间总和，并具有信号的长时间稳定性，可以实现长时间稳定检测和同时监控。附图说明10.图1为本发明的实验机理示意图。11.图2为本发明分析方法对afp以及afp-l3检测的分析性能示意图。12.图3为本发明分析方法对目标物的选择性结果图。13.图4为本发明分析方法对模拟样品检测结果图。14.图5为本发明分析方法对实际样品检测的分析性能示意图。15.下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。16.实施例1、实验中，afp-l3的浓度为0.5ngml-1至10ngml-1,由图可以看出，在该范围内，afp-l3浓度与109ag的icpms强度信号（y）成线性相关关系。线性方程为y=24783x+242161,相关系数r2=0.997,检出限（lod）为0.1ngml-1；afp的浓度为0.5ngml-1至16ngml-1,在该范围内，afp浓度与197au的icpms强度信号（y）成线性相关关系。线性方程为y=12162x+23425,相关系数r2=0.993,检出限（lod）为0.2ngml-1；本实施例充分证明，本发明可以实现对甲胎蛋白及其异质体进行高灵敏的定量分析。17.实施例2、探究本发明分析方法对甲胎蛋白及其异质体检测的特异性本实施例利用无机质谱双元素标记的甲胎蛋白及其异质体分析法对几种血清中同样存在或常见的蛋白质进行检测，探究该方法的特异性。我们筛选了人血清中的蛋白质和人血清中的其他广谱肿瘤标志物，以避免基质的干扰。基于免疫分析的特异性识别，只有靶抗原afp和afp-l3可以通过免疫反应被磁性微球上的抗afp抗体捕获，因此afp或afp-l3获得的信号强度远高于非靶抗原。人免疫球蛋白g（igg）、人癌胚抗原（cea）、人糖类抗原19-9（ca19-9）和牛血清白蛋白（bsa）由于抗体的特异性识别能力，对捕获过程没有明显的交叉干扰，在复杂基质样品中具有良好的选择性和适用性。18.实施例3、探究本发明分析方法对模拟混合样品中甲胎蛋白及其异质体的检测为了验证所提出的方法在同一样品中同时检测两种抗原的能力，本发明测量了几种混合生物标记物样品，结果如表1所示。afp-l3的浓度维持在10ngml-1，通过调节afp-l3的浓度为5%、20%和40%来模拟血液中的一系列afp-l3%。定量结果展现出了两种生物标志物同时测定的可行性，可用于模拟afp-l3比率的有效诊断范围。19.实施例4、探究本发明分析方法对实际样品中甲胎蛋白及其异质体的检测本实施例以afp及afp-l3为例，探究方法在实际样品基质中的检测能力。20.1.样品前处理：离心除去细胞碎片等固体杂质。21.2.实验步骤：取50μl血清样品和1μl抗体组装的磁性微球在37℃孵育器中反应60min。磁性分离后，加入100μlag-lca与au-mpba探针混合溶液，反应50min，磁性分离后去除上清液再经过酸消解利用icpms检测。22.分别把afp与afp-l3的稳定同位素检测结果代入线性方程中算得检测浓度结果。23.3.数据处理：将109ag与197au强度结果带入线性方程，计算出测量浓度结果，重读三次，计算与其他方法测定结果的拟合程度和标准偏差。24.4．检测结果：结果见表，本发明分析方法对实际血清浓度为ppb的样本具有定量能力，进一步证实了该方法在临床生理样品中的适用性。25.下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。26.实施例1、实验中，afp-l3的浓度为0.5ngml-1至10ngml-1,由图可以看出，在该范围内，afp-l3浓度与109ag的icpms强度信号（y）成线性相关关系。线性方程为y=24783x+242161,相关系数r2=0.997,检出限（lod）为0.1ngml-1；afp的浓度为0.5ngml-1至16ngml-1,在该范围内，afp浓度与197au的icpms强度信号（y）成线性相关关系。线性方程为y=12162x+23425,相关系数r2=0.993,检出限（lod）为0.2ngml-1。27.本实施例充分证明，本发明可以实现对甲胎蛋白及其异质体进行高灵敏的定量分析。28.实施例2、探究本发明分析方法对甲胎蛋白及其异质体检测的特异性本实施例利用无机质谱双元素标记的甲胎蛋白及其异质体分析法对几种血清中同样存在或常见的蛋白质进行检测，探究该方法的特异性。我们筛选了人血清中的蛋白质和人血清中的其他广谱肿瘤标志物，以避免基质的干扰。基于免疫分析的特异性识别，只有靶抗原afp和afp-l3可以通过免疫反应被磁性微球上的抗afp抗体捕获，因此afp或afp-l3获得的信号强度远高于非靶抗原。人免疫球蛋白g（igg）、人癌胚抗原（cea）、人糖类抗原19-9（ca19-9）和牛血清白蛋白（bsa）由于抗体的特异性识别能力，对捕获过程没有明显的交叉干扰，在复杂基质样品中具有良好的选择性和适用性。29.实施例3、探究本发明分析方法对模拟混合样品中甲胎蛋白及其异质体的检测为了验证所提出的方法在同一样品中同时检测两种抗原的能力，本发明测量了几种混合生物标记物样品，结果如表1所示。afp-l3的浓度维持在10ngml-1，通过调节afp-l3的浓度为5%、20%和40%来模拟血液中的一系列afp-l3%。定量结果展现出了两种生物标志物同时测定的可行性，可用于模拟afp-l3比率的有效诊断范围。30.实施例4、探究本发明分析方法对实际样品中甲胎蛋白及其异质体的检测本实施例以afp及afp-l3为例，探究方法在实际样品基质中的检测能力。31.1.样品前处理：离心除去细胞碎片等固体杂质。32.2.实验步骤：取50μl血清样品和1μl抗体组装的磁性微球在37℃孵育器中反应60min。磁性分离后，加入100μlag-lca与au-mpba探针混合溶液，反应50min，磁性分离后去除上清液再经过酸消解利用icpms检测。33.分别把afp与afp-l3的稳定同位素检测结果代入线性方程中算得检测浓度结果。34.3.数据处理：将109ag与197au强度结果带入线性方程，计算出测量浓度结果，重读三次，计算与其他方法测定结果的拟合程度和标准偏差。35.4．检测结果：结果见表，本发明分析方法对实际血清浓度为ppb的样本具有定量能力，进一步证实了该方法在临床生理样品中的适用性。36.具体实施方式37.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经milli-q超纯水净化系统处理而成。下述实例中所有样品在使用前均未进行纯化。38.本发明按以下具体步骤进行：a.生物素化的抗体和链霉亲和素修饰的磁性微球的复合a1取1μl链霉亲和素修饰的磁性微球用200μl10mmpbs（ph=7.4）于ep管中预洗涤三次，a2将生物素化的捕获抗体在10mmpbs缓冲溶液（ph=7.4）中在室温下振荡反应30-60min，a3在磁力架上将反应后的溶液磁性分离，析出上清液，用10mmpbst（ph=7.4）溶液清洗三次。39.b.抗体-磁性微球复合物的位点封闭b1用1%的牛血清蛋白（bsa）溶液对磁性微球的蛋白位点进行封闭，条件为30min、20-25摄氏度振荡孵育；反应后再次在磁力架上，用10mmpbst（ph=7.4）溶液清洗三次；b2用5mm的巯基苯硼酸（mbba）溶液对磁性微球及抗体上的糖位点进行封闭，条件为30min、37摄氏度振荡孵育；反应后再次在磁力架上，用10mmpbst（ph=7.4）溶液清洗三次。40.c.抗原与抗体的免疫反应，c1取50μl甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和预接抗体的磁性微球进行免疫反应，振荡孵育，时间为60min,温度为37℃，反应后再次在磁力架上，加入200μl10mmpbst（ph=7.4）溶液清洗三次。41.d.agnps和aunps探针的合成与标记d1将实验室制备的agnps稀释三倍后与lca进行反应，随后在6500rpm转速下离心15min，用pbs（ph=7.4）溶液洗涤三次，重悬于500μlpbs（ph=7.4）中；d2将实验室制备的aunps与mpba进行反应，陈化24小时后在6000rpm转速下离心15min，用pbs（ph=7.4）溶液洗涤三次，重悬于500μlpbs（ph=7.4）中；d3在连接了抗原与抗体的磁性微球中加入agnps-lca和aunps-mpba探针各50μl，在37摄氏度的孵育器中振荡反应45min；d4磁性分离后去除上清液，加入2倍稀释的王水200μl，在孵育器中剧烈振荡消解agnps和aunps，反应温度为25-30℃，时间为60min。42.e．icpms测定e1将硝酸消解后的溶液稀释至4ml，并转移至ep管,e2在icpms中对109ag、197au同位素进行检测，std模式,e3以109ag、197au为标准，对所测得强度代入线性方程计算浓度。当前第1页12当前第1页12