一种可用于临床样品等位基因分型的DNA纳米筛可再生电化学传感器的制作方法

一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器
技术领域
[0001]
本发明涉及可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器的制备方法，属于生物传感技术领域。


背景技术：

[0002]
单核苷酸多态性（snps），也称点突变，是癌症诊断和预后有价值的遗传标志，也是预测药物疗效及耐药性的重要指标之一。目前，大多数应用于snps的检测方法是基于pcr扩增技术和直接测序法，但这些方法成本高、需要精密的仪器设备且对人工操作高要求，以及在检测低丰度点突变方面能力有待提高，因此，不适合作为临床常规性的诊断工具。dna电化学传感器由于具有灵敏度高、成本低、信号读出方式简便以及易于微型化等优点，在snp检测以及开发成床边检测工具方面具有其独特的优势。
[0003]
随着工具酶、纳米材料及分子器件的引入，dna电化学传感器的灵敏度和特异性不断提升，然而它的稳定性和重现性一直困扰着广大科研工作者。传感器在组装过程中不可避免会产生批间差异，即传感器间的差异（chip-to-chip variance），主要包括基底差异以及界面功能化修饰差异，是导致传感器重现性差的主要原因之一
[1]
。而通过构建可再生传感器，实现单一传感器对多个样品的连续检测，可有效地消除传感器间的差异，不仅进一步降低成本，且提高了传感器的重现性、可靠性以及准确性
[2]
。
[0004]
为实现dna电化学传感器的再生，已报道方法的切入点主要是考虑如何破坏dna双链间的氢键，如通常采用改变ph值、提高温度和添加化学试剂（胍盐、尿素或甘氨酸等）
[3-7]
等方法。然而，这些方法不仅会改变界面离子的种类和排布，还会不可逆地破坏界面上dna捕获探针的二级结构，使dna自组装单分子层的电荷和构象发生改变，难以获得持续且可靠的再生效果
[2]
。因此，迫切需要从另一个角度来开发具有高稳定性和可靠性的可再生dna电化学传感器。
[0005]
通常，用于dna检测的dna电化学传感器的制备包括在电极表面上形成dna 自组装单分子层（sam），通过靶标诱导的三明治结构与标记探针进行非共价杂交，以及使用电化学技术监控电子转移过程。在“信号开”的检测模式下，通常需要采用“倒立型杂交三明治”使如亚甲基蓝（mb）和二茂铁（fc）等电活性物质靠近电极表面。值得注意的是，这种倒立型杂交过程与通常在酶催化的dna电化学传感器
[8]
中使用的“正立型杂交模式”完全不同。对于后者，仅需要参与杂交的单链dna（ssdna）部分进入sam即可完成杂交，但是，前者需要整个双链dna（dsdna）部分渗透进入sam，使得突出的ssdna与捕获探针充分碰撞才能形成三明治结构。据我们所知，ssdna像羊毛球一样盘绕，而dsdna具有像棍棒一样的刚性结构特征，因此，这种明显的柔韧性差异应使它们对sam具有不同的渗透性。
[0006]
基于以上讨论，本发明公开一种新型的可再生dna电化学传感器，通过调节巯基修饰dna浓度来对sam的探针间距进行纳米调控，形成能够区分ssdna和dsdna的dna纳米筛。我们假设，棒状dsdna由于其长度大于纳米筛的腔长，会被阻挡在纳米筛之外，不能以倒置的
2020, 92(6):4498-4503.[9] johnson-buck, a.; su, x.; giraldez, m. d.; zhao, m.; tewari, m.; walter, n. g. kinetic fingerprinting to identify and count single nucleic acids. nat. biotechnol. 2015, 33 (7), 730-732。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种可用于临床样品等位基因分型的dna纳米筛可再生电化学传感器及其对cyp2c19等位基因分型的电化学传感方法。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛界面用于对cyp2c19等位基因分型的电化学传感方法，其特征是通过巯基修饰dna（capture probe）在金电极表面的自组装构建一种能够区分ssdna和dsdna的界面型dna纳米筛，其空腔大小能通过改变巯基修饰dna的浓度来调节，通过以[ru(nh3)6]
3+
为氧化还原的电化学计时库仑法对界面上巯基修饰dna的间距进行表征，当巯基修饰dna的间距小于dsdna的长度时，dsdna由于其刚性结构不能透过dna纳米筛，而无规则卷曲结构的ssdna由于其高度的柔韧性能进入纳米筛，接着以连接酶循环反应为ssdna扩增策略对样品中的等位基因进行扩增，用所构建的dna纳米筛传感界面对ssdna进行检测，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析；在检测完成后，加入再生探针破坏ssdna的动态杂交过程，形成的dsdna由于其刚性结构且长度大于巯基修饰dna的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极能再生并用于下一次检测，单个传感器能对7个不同样品进行连续检测。
[0010]
所述的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛界面的制备方法，包括如下步骤：（1）金电极用0.05 μm al2o3和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗；将超声好的电极置于0.5 m h2so4中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，n2吹干后待用；（2）将巯基修饰dna分别稀释至以下浓度： 2 μm、1 μm、800 nm、600 nm、500 nm、400 nm、200 nm；取3 μl上述各浓度的巯基修饰dna溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜后，以pbs洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mm mch溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用；（3）将步骤（2）获得的电极浸入ph=7.4、浓度为10 mm的tris-hcl中进行第一次计时电量法测量，电压0 v至-0.5 v，500 ms，记录截距值q1；测量完成后将电极浸入50 μm氯化六胺合钌溶液中，室温孵育10 min，之后将电极用双蒸水彻底冲洗后再次浸入ph=7.4、浓度为10 mm的tris-hcl中进行第二次计时电量法测量，电压0 v至-0.5 v，500 ms，记录截距值q2，并计算两次测量得到的截距值的差值：δq=q2-q1；（4）将步骤（3）得到的δq代入以下公式：,其中γ0表示限定在电极表面附近的氯化六胺合钌的量，n是每个氧化还原过程转移的电子数，n=1，f是法拉第常数：f=96485.33289
±
0.00059 c/mol，a是电极面积；将计算得到的γ0代入公式：
，其中γ
dna
表示界面巯基修饰dna的密度，z是氧化还原分子所带的电荷量：z=3，m是巯基修饰dna的碱基个数：m=63，n
a
是阿伏伽德罗常数：n
a
≈6.02
×
10
23
；（5）计算探针间距：每个巯基修饰dna周围有一个圆圈面积，通过γ
dna
值的倒数来估算这个面积，从而由这个圆圈面积的直径计算出dna与dna之间的平均距离；得到dna间距小于17.34 nm的可再生dna纳米筛电化学传感界面。
[0011]
所述的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛界面的再生方法，其特征是利用短寡核苷酸杂交的动态性，通过加入一条与被检测ssdna部分互补的再生探针，在ssdna处于杂交解离态时与其杂交形成dsdna，所形成的dsdna由于其刚性结构且几何长度大于纳米筛界面的空腔而被阻隔，从而使ssdna从界面脱落，使传感界面实现再生并可用于下一次ssdna的检测。
[0012]
所述的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛界面构建及其对cyp2c19等位基因分型所涉及到的所有脱氧核苷酸序列，包括巯基修饰dna，lcr引物ap与sp以及再生探针rp:
[0013]
具体地说，本发明采用以下技术方案：（一）基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛界面的构建根据文献报道，随着巯基修饰dna（capture probe）的浓度的增加，在金电极界面所构建的dna自组装层的密度就越大，即巯基修饰dna间的距离减少。根据这一原理，首先将一系列浓度梯度的巯基修饰dna（序列见表1）固定于金电极表面，接着用巯基己醇（mch）对界面上剩余活性位点进行封闭，从而获得一定密度的dna自组装层。接着利用氯化六胺合钌能与dna磷酸骨架静电结合的特点，通过计时电量法对界面上捕获探针的密度以及间距进行定量分析。本发明所设计的cyp2c19等位基因目标序列长度为51 nt，可计算得出其与互补序列杂交后形成的dna双链的几何长度为17.34 nm，因此我们以捕获探针间距小于17.34 nm时的巯基修饰dna浓度为最优浓度用于后续实验。
[0014]
（二）pcr扩增技术结合连接循环反应（lcr）对样品中的cyp2c19等位基因进行扩增首先，从ncbi基因数据库genbank中，查找cyp2c19*2全基因序列，选取含突变位点的基因片段共1170 nt，设计上下游引物对全血样品的核酸总提物进行扩增，接着利用耐热连接酶（ampligase）具有特异性区分单碱基错配的能力，构建连接循环反应（lcr）信号放大体系，其原理见示意图1：存在完全互补的目标链时，ap（5’端的12个碱基可与捕获探针杂交）
和sp（3’端修饰亚甲基蓝mb）与目标链杂交后形成含有缺口的双链dna，ampligase催化缺口处的3
’-
oh与5
’-
po4形成磷酸二酯键，94 ℃高温解链后得到加长的ssdna（ap-sp），通过“94 ℃解链-53 ℃连接”的温度循环，得到大量的ssdna扩增产物；若为点突变目标链，则ap、sp与其杂交后在缺口处存在碱基错配，此时ampligase无法发挥其催化功能。
[0015]
（三）基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感界面用于cyp2c19等位基因分型将lcr扩增产物（ap-sp）与可再生dna纳米筛电化学传感界面的捕获探针进行杂交，使sp末端的电活性物质亚甲基蓝（mb）靠近电极表面产生电子传递，通过方波伏安法对电信号进行采集并纪录峰电流值。接着加入再生探针rp，由于ap-sp与巯基修饰dna的杂交区域只有12 bp，因此该杂交存在动态过程，rp会在ap-sp处于杂交解离态时与其杂交形成刚性dna双链，由于其几何长度17 nm大于巯基修饰dna间距而无法进入dna自组装层进行杂交，从而使ap-sp从电极表面脱落，实现传感器再生并可接着进行下一个样品的检测。单个传感器可连续检测7个样品，最终根据每个样品所采集的峰电流大小可实现临床样品中cyp2c19等位基因准确分型。利用3个本发明所构建的可再生传感器对21例临床样品的检测结果如图2，方波伏安法峰电流值主要分布在3个区域：107 na~144 na（高）, 62 na~74 na（中）, 18 na~30 na（低）。对此，我们根据实验原理将信号落在高、中、低三个区域的样品分别判定为cyp2c19*2, cyp2c19*1 和 cyp2c19*1*2。同时，为了验证所构建的传感器检测的准确性，我们将这21例样品进行了测序（snp检测的金标准），测序结果如图3所示，我们将电化学检测结果与测序结果进行比对，发现这两者结果完全吻合，证明了所构建的基于可再生纳米筛的dna电化学传感器在临床样品核酸检测中具有高准确性。
[0016]
由上述技术方案可知，本发明所述的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感器可用于临床样品中cyp2c19等位基因的准确分型，并且利用所设计的新型再生策略可实现单个传感器对7个不同样品的高通量检测，一方面消除传感器间的差异，提高了分析的准确度，另一方面进一步降低了检测成本。
附图说明
[0017]
图1为基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感器的原理图。
[0018]
图2为三个独立可再生传感器检测21例人的全血样品核酸总提物的pcr产物的检测图，图中：（a）为方波伏安法响应值，（b）为方波伏安法图。
[0019]
图3为所检测的21例人的全血样品的基因测序图，其中第243个碱基为g的是cyp2c19*1纯野生基因型，为a的是cyp2c19*2纯突变基因型，为g/a的是cyp2c19*1*2杂合基因型。
具体实施方式
[0020]
如图1所示，本发明所述的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感器，包括电极、巯基修饰dna(capture probe)、lcr引物、耐热连接酶、巯基己醇和再生探针rp，电极优选金电极，lcr引物包括ap（5’端的12个碱基可与巯基修饰dna杂交）和sp（3’端修饰亚甲基蓝mb），ap和sp与目标链杂交后形成含有缺口的双链dna，耐热连接酶ampligase催化缺口处的3
’ꢀ
oh与5
’ꢀ
po4形成磷酸二酯键，94 ℃高温解链后得到加长的ssdna（ap-sp），
通过“94 ℃解链-53 ℃连接”的温度循环，得到大量的ssdna扩增产物；若为点突变目标链，ap、sp与其杂交后在缺口处存在碱基错配，此时ampligase的催化效率将大大降低，因此得到的ssdna较少。将扩增得到的ssdna与通过金巯键固定于金电极表面的巯基修饰dna杂交，使sp末端的短程电活性物质亚甲基蓝mb靠近电极表面产生电子传递，使用方波伏安法对电信号进行采集，根据电流大小实现对目标链的定性定量分析。在检测完成后，加入可再生探针破坏ssdna的动态杂交过程，形成的dsdna由于其刚性结构且长度大于捕获探针dna的间距而无法杂交，从而使信号物质从电极表面脱落，电极再生并可用于下一次检测，单个传感器可对7个不同样品进行连续检测，一方面消除传感器间的差异，提高了分析的准确度，另一方面进一步降低了检测成本。本发明中涉及的核酸序列表以及实施例所用的核酸序列表见表1，为已知产品，由takara公司提供合成服务。
[0021]
表1.本发明中涉及的核酸序列表
[0022]
实施例1：基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感界面用于临床样品中cyp2c19等位基因分型的步骤如下：（1）在可再生dna纳米筛电化学传感界面上滴加3 μl的lcr反应液，室温杂交1 h，用10 mm 的pbs洗液（ph 7.4）冲洗电极表面，除去未杂交的dna链，再用双蒸水冲洗后待测；（2）将步骤（2）制得的电极浸入电解液（10 mm pbs, 1 m nacl, ph=7.4）中，初始电位为-0.05 v, 终电位为-0.45 v，频率为100 hz，振幅为25 mv ,记录方波伏安法电流曲线后用pbs小心冲洗，氮气吹干备用。
[0023]
（3）将3 μl再生探针rp（1 μm）滴加到步骤（5）得到的电极表面，室温孵育5 min，用双蒸水冲洗后氮气吹干后重复步骤（1）、步骤（2）进行下一个样品检测。单个传感器可进行7次检测。
[0024]
实施例2：上述实施例1中的基于界面探针密度调控的可再生dna纳米筛电化学传感界面的制备步骤如下：（1）金电极用0.05 μm al2o3和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 m h2so4中循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，n2吹干后待用；（2）将巯基修饰dna分别稀释至以下浓度： 2 μm、1 μm、800 nm、600 nm、500 nm、400 nm、200 nm。取3 μl各浓度的巯基修饰dna溶液分别滴至经预处理的裸金电极表面，室温放置过夜（16 h）后，以pbs洗液冲洗电极表面，氮气吹干后将电极置于100 μl的2 mm 巯基己
醇溶液中浸泡2 h，用双蒸水清洗，氮气吹干备用。
[0025]
（3）将步骤（2）获得的电极浸入10 mm tris-hcl（ph=7.4）进行第一次计时电量法测量（电压0 v至-0.5 v，500 ms），记录截距值q1。测量完成后将电极浸入50 μm氯化六胺合钌溶液中，室温孵育10 min，之后将电极用双蒸水彻底冲洗后再次浸入10 mm tris-hcl（ph=7.4）进行第二次计时电量法测量（电压0 v至-0.5 v，500 ms），记录截距值q2，并计算两次测量得到的截距值的差值：δq=q2-q1。
[0026]
（4）将步骤（3）得到的δq代入以下公式：,其中γ0表示限定在电极表面附近的氯化六胺合钌的量，n是每个氧化还原过程转移的电子数（n=1），f是法拉第常数（f=96485.33289
±
0.00059 c/mol），a是电极面积。将计算得到的γ0代入公式：，其中γ
dna
表示界面巯基修饰dna的密度，z是氧化还原分子所带的电荷量（z=3），m是巯基修饰dna的碱基个数（m=63），n
a
是阿伏伽德罗常数（n
a
≈6.02
×
10
23
）。
[0027]
（5）计算探针间距：假设每个巯基修饰dna周围有一个圆圈面积，通过γ
dna
值的倒数来估算这个面积，从而由这个圆圈面积的直径计算出dna与dna之间的平均距离。得到dna间距小于17.34 nm的可再生dna纳米筛电化学传感界面。
[0028]
实施例3：上述实施例1所用到的lcr反应液的制备： 将4 μl ap（1 μm）、4 μl sp（1 μm）、0.2 μl ampligase（5 u/μl, 购自美国lucigen公司）、5.0 μl reaction buffer（10
×
，购自美国lucigen公司）与1 μl cyp2c19等位基因pcr扩增产物的混合溶液充分混匀，放入pcr仪进行扩增，反应条件：53 ℃ 2 min
ꢀ-ꢀ
94 ℃ 1 min，30个循环。反应完成后，加入2.63 μl的0.2 m 磷酸盐缓冲液（ph=7.4）。
[0029]
实施例4：上述实施例2所用的cyp2c19等位基因pcr扩增产物的制备方法：将1 μl的正向引物（5
’-
aagcaggtataagtctaggaaatga-3’）、1 μl反向引物（5
’-
actccttgacctgttaaacatccgt-3’）、1 μl模板、1 μl dntp (10 mm, 购自上海生工公司)、5 μl taq buffer（购自上海生工公司）、5 μl mgcl2（25 mm，购自上海生工公司）、0.5 μl taq酶（5 u/μl，购自上海生工公司）与15.5 μl 水的混合溶液充分混匀，放入pcr仪进行反应，反应条件：95 ℃预变性3 min后，“94 ℃ 30s
ꢀ-
55 ℃ 35s
ꢀ-ꢀ
72 ℃ 45s”30个循环，最后72 ℃修复延伸7 min。
[0030]
实施例5：将lcr扩增产物（ap-sp）与可再生dna纳米筛电化学传感界面的捕获探针进行杂交，使sp末端的电活性物质亚甲基蓝（mb）靠近电极表面产生电子传递，通过方波伏安法对电信号进行采集并纪录峰电流值。接着加入再生探针rp，由于ap-sp与巯基修饰dna的杂交区域只有12 bp，因此该杂交存在动态过程，rp会在ap-sp处于杂交解离态时与其杂交形成刚性dna双链，由于其几何长度17 nm大于巯基修饰dna间距而无法进入dna自组装层进行杂交，从而使ap-sp从电极表面脱落，实现传感器再生并可接着进行下一个样品的检测。单个传感器可连续检测7个样品，最终根据每个样品所采集的峰电流大小可实现临床样品中cyp2c19等位基因准确分型。利用3个本发明所构建的可再生传感器对21例临床样品的检测结果如图2，
方波伏安法峰电流值主要分布在3个区域：107 na~144 na（高）, 62 na~74 na（中）, 18 na~30 na（低）。对此，我们根据实验原理将信号落在高、中、低三个区域的样品分别判定为cyp2c19*2, cyp2c19*1 和 cyp2c19*1*2。同时，为了验证所构建的传感器检测的准确性，我们将这21例样品进行了测序（snp检测的金标准），测序结果如图3所示，我们将电化学检测结果与测序结果进行比对，发现这两者结果完全吻合，证明了所构建的基于可再生纳米筛的dna电化学传感器在临床样品核酸检测中具有高准确性。