一种用于手性色氨酸检测的外延栅极场效应晶体管传感器制备及检测方法与流程

[0001]
一种用于手性色氨酸检测的外延栅极场效应晶体管传感器制备及检测方法，涉及手性分子传感器领域。


背景技术：

[0002]
手性是大自然的天然属性，手性分子在医学，药学，食品化学及手性合成等领域具有广泛的应用前景，但是手性对映异构体的生理药理活性可能截然不同。例如沙利度胺右旋异构体具有镇静作用，而左旋异构体却是引发致畸性的罪魁祸首。左旋多巴是治疗帕金森综合症的首选药物，而右旋药物则会造成粒状白细胞减少，因此手性对映异构体的区别拆分尤为重要。氨基酸作为一种典型的手性化合物，在维持人体正常生理、免疫及新陈代谢方面发挥重要作用。其中色氨酸(trp)是一种人体必需氨基酸，是脑内单胺类神经递质5-羟色胺的前体物质，色氨酸含量与抑郁症有着密切联系，而当畜禽缺乏色氨酸时，则会引起生长停滞，体重下降等问题。鉴于光学异构体相似的物理化学性质，氨基酸的手性识别仍然被认为是十分棘手的问题之一。
[0003]
大多数生物大分子，如蛋白质、核酸和天然多糖都具有手性结构单元，特别是由手性亚单位(l-氨基酸)组成的蛋白质能够特异性结合小分子。蛋白质如牛血清白蛋白、人血清白蛋白等被广泛用于构建手性传感界面以实现手性拆分，其中牛血清白蛋白价格低廉，易改性、易固定及具有独特的手性识别能力而成为手性分离介质的首选。目前牛血清白蛋白作为手性分离介质常用在色谱，毛细管电泳、质谱、荧光等领域，但由于这些检测手段的设备体积大，耗时长，灵敏度低且难以实现在线实时检测等，故在实际应用方面具有很大的局限性。场效应晶体管固有的信号放大及信号传导能力在生物传感领域受到广泛关注，已经实现了对气体，抗原，葡萄糖等物质的检测。大多数传感层构建都基于器件本身，例如有机场效应晶体管传感器，此类器件的有机半导体层或许对水系环境十分敏感，因此液体环境会对器件性能造成不可逆损害，导致器件无法正常工作，所以此类器件为达到稳定的测试性能往往具有复杂的制备过程或半导体层材料改性过程。商用mos管因具有成本低、设备小巧、信号灵敏、稳定性高等优势尤其引起研究者极大的兴趣。
[0004]
在商用mos管稳定输出性能的基础上，本发明为减少对设备的损害，将敏感驱动元件与器件分离，采用外延栅极结构，可方便更换传感芯片，实现器件重复利用。本发明构建的牛血清白蛋白场效应晶体管传感器及检测方法整合了场效应晶体管放大信号和牛血清白蛋白手性识别的优势，实现低浓度范围手性色氨酸分子的快速、灵敏、实时在线检测，构建手性对映异构体识别的新型应用载体。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是针对上述技术分析，结合场效应晶体管的输出信号放大能力和牛血清白蛋白的手性识别特性，提供一种检测手性色氨酸分子的外延栅极场效应晶体管生物
传感器——牛血清白蛋白外延栅极制备方法，并将其应用于构建mos管传感器，实现低压下对pm浓度级别的手性对映异构体高效灵敏区别响应。检测灵敏度明显高于色谱、电化学等检测方法，耗时短且实现了实时在线检测，有望作为现场检测新型应用平台。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
一种用于检测手性色氨酸分子的外延栅极场效应晶体管传感器，将外延栅极浸泡在牛血清白蛋白溶液中，栅极表面形成一层有序的牛血清白蛋白分子，完成手性分离介质的固定，制得手性传感芯片，为牛血清白蛋白外延栅极场效应晶体管生物传感器。
[0008]
本发明的一种用于检测手性色氨酸分子的外延栅极场效应晶体管传感器制备方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)外延栅极的制备：使用丙酮，乙醇，异丙醇或其他有机溶剂超声清洗玻璃基底达到清除表面污物的效果；然后在乙醇溶液中煮沸，氮气吹干后在玻璃基板上蒸镀au薄膜；
[0010]
(2)修饰外延栅极：配制1～10mg/ml的蛋白质溶液，外延栅极浸泡其中1～12h后取出，用去离子水冲洗，除去物理吸附的牛血清白蛋白，在au表面形成蛋白质分子层；
[0011]
(3)制备用于储存分析液的pdms样品池：将a胶与b胶均匀混合，抽真空除气泡后倒入盛有模具的容器中，升温固化后制得样品池，利用pdms与au的粘附力可固定于修饰后的外延栅极上。
[0012]
所述的步骤(1)玻璃片的长为0.5cm～2.5cm，宽为0.5cm～2.5cm，高为0.2cm～0.5cm，超声清洗时间为10～20min，乙醇煮沸时间为10～20min，真空度为10-4
pa，au膜的厚度为80～100nm，蒸镀速率为
[0013]
所述的步骤(2)使用的磷酸盐缓冲溶液浓度为10mm，ph＝7.2，牛血清白蛋白溶液浓度为1～10mg/ml，浸泡时间为1～12h。
[0014]
所述的步骤(3)a胶：b胶质量比为10：1～1：1，温度为20～100℃，固化时间为30～60min。
[0015]
利用本发明的传感器检测手性色氨酸分子的方法；包括以下步骤：
[0016]
(1)手性色氨酸分析液配制：使用磷酸盐缓冲溶液将d-或l-色氨酸配制成不同浓度标准溶液，浓度为0～10μm；
[0017]
(2)器件转移特性曲线测试：测试修饰牛血清白蛋白后外延栅极场效应晶体管转移特性曲线；
[0018]
(3)实时基线测试：固定测试栅压、源漏电压，向样品池中加入pbs缓冲液，测试获得的实时漏极电流曲线作为基线i0；
[0019]
(4)手性色氨酸的实时检测：固定测试栅压、源漏电压，向样品池中加入浓度为0～10μm的d-或l-色氨酸，用mos管漏极电流变化量(i-i0)评估传感器对不同浓度的手性色氨酸溶液实时感测结果。
[0020]
所述步骤(2)重复测试次数为3次。
[0021]
所述步骤(1)、步骤(3)、步骤(4)中使用的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.1mm～10mm。
[0022]
所述步骤(3)、步骤(4)设定的栅压，源漏电压皆为1～2v。
[0023]
所述步骤(3)、步骤(4)每个浓度使用的分析液体积为10～30μl。
[0024]
本发明的一种用于检测手性色氨酸分子的外延栅极场效应晶体管传感器，为牛血清白蛋白外延栅极场效应晶体管生物传感器。本传感器使用商用mos管，无需制备器件，仅
需制备外延栅极，搭建传感平台，包括外延栅极的制备及检测方法构建。
[0025]
所述传感器结构包括mos管(1)，pdms样品池(2)，铜丝(3)以及牛血清白蛋白(4)修饰的外延栅极(5)芯片。
[0026]
外延栅极(5)通过在玻璃片真空蒸镀金膜得到，将其浸泡在牛血清白蛋白溶液中，利用蛋白质巯基与金形成s-au化学键，在栅极表面形成一层有序的蛋白质分子，得到外延栅极手性传感芯片。pdms样品池(2)通过将a胶(主剂)与b胶(硬化剂)均匀混合，倒入模具，升温固化后得到，利用pdms与金之间的粘附力可固定于外延栅极。
[0027]
传感器检测方法为：利用样品池内液体与固定悬挂的铜丝接触，通过向样品池中加入不同构型和浓度的分析液，根据手性分子与牛血清白蛋白作用后引起的mos管实时电流的变化量大小，实现手性区分。
[0028]
所述外延栅极场效应晶体管传感器，其特征在于场效应晶体管漏极电流对d-，l-色氨酸浓度的变化随时间呈现出十分明显的梯度变化，且与未修饰牛血清白蛋白的外延栅极场效应晶体管对比，不同浓度下的漏电流变化量变大。当分析液浓度梯度变化时，电流变化量(i-i0)呈梯度下降，且l-trp引起的电流变化量更明显，变化率为-10％～-40％，说明l-trp与牛血清白蛋白的作用力更强，表现出牛血清白蛋白所提供的手性微环境在手性对映异构体区别响应方面具有重要作用。且外延栅极结构减小了液体环境对器件本身的损害，可实现器件和传感芯片的多次使用，操作简便，为实际应用奠定基础。
[0029]
一种用于手性色氨酸检测的外延栅极场效应晶体管传感器检测方法包括以下步骤：
[0030]
步骤(1)手性色氨酸分析液配制：使用磷酸盐缓冲溶液将d-或l-色氨酸配制成不同浓度标准溶液，浓度为0～10μm。
[0031]
步骤(2)器件转移特性曲线测试：测试修饰牛血清白蛋白后外延栅极场效应晶体管转移特性曲线，附图3为转移特性曲线稳定性测试图，检验器件是否正常工作。
[0032]
步骤(3)实时基线测试：固定测试栅压、源漏电压，向样品池中加入pbs缓冲液，测试获得的实时漏极电流曲线作为基线i0。
[0033]
步骤(4)手性色氨酸的实时检测：固定测试栅压、源漏电压，向样品池中加入浓度为0～10μm的d-或l-色氨酸，用mos管漏极电流变化量(i-i0)评估传感器对不同浓度的手性色氨酸溶液实时感测结果。如附图4所示，可以看出修饰后器件的传感性能优于未修饰的器件，对色氨酸浓度的响应更加明显。由附图5可以看出，在分析液浓度低至pm级别时，该检测平台依然可实现对色氨酸的手性区分。总之，当分析液浓度梯度变化时，电流变化量(i-i0)呈梯度下降，且l-trp引起的电流变化量更明显，变化率为-10％～-40％，说明l-trp与牛血清白蛋白的作用力更强，所构建的实时分析平台可以依据不同构型引起的电流变化量大小实现对手性分子的识别。
[0034]
本发明的优势在于：1、利用牛血清白蛋白外延栅极场效应晶体管结构，减小了液体环境对器件的损害，并可在低电压下实现对手性色氨酸的快速简便灵敏区别响应，最低检测浓度在pm级别。2、摆脱了传统的参比电极，仅用一根固定的铜丝实现与样品池中分析液接触，通过外延栅极传导并放大电信号，响应明显，检测灵敏度高，耗时短。3、本传感器结构及检测方法简单，可实现器件和传感芯片的多次使用，适合规模化制备和应用，有望作为现场检测新型应用载体。
附图说明
[0035]
图1本发明所述牛血清白蛋白修饰的外延栅极mos管传感器实时测试结构
[0036]
图2裸金膜及修饰牛血清白蛋白后的金膜表面循环伏安测试图
[0037]
图3蛋白修饰的外延栅极mos管转移特性曲线稳定性测试图
[0038]
图4 0，100nm，1μm，10μm浓度范围的d-或l-色氨酸实时测试图
[0039]
图5 0，100pm，1nm，10nm，100nm，1μm浓度范围的d-或l-色氨酸实时测试图
具体实施方式
[0040]
下面结合具体附图和实施例，对本发明做进一步阐述。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0041]
实施例1
[0042]
一、牛血清白蛋白修饰的外延栅极场效应晶体管传感器构成
[0043]
本发明提供了一种用于手性色氨酸检测的外延栅极场效应晶体管传感器检测方法，方案实施主要涵盖传感芯片的制备以及手性色氨酸分子实时检测的具体方法。外延栅极mos管传感器结构如附图1所示，包括mos管(1)，pdms样品池(2)，铜丝(3)以及牛血清白蛋白(bsa)(4)修饰的外延栅极(5)芯片。本传感器使用商用mos管，无需复杂的器件制备过程，仅需制备外延栅极。
[0044]
二、外延栅极的制备，包括以下步骤：
[0045]
步骤(1)外延栅极的制备
[0046]
玻璃基底长为1.5cm，宽为0.5cm，高为0.2cm，使用丙酮，乙醇，异丙醇超声清洗15min，乙醇煮沸玻璃片15min，氮气吹干。在真空度为10-4
pa的条件下，蒸镀100nm au薄膜，蒸镀速率为
[0047]
步骤(2)修饰外延栅极
[0048]
将30mg bsa溶于3ml 10mm的磷酸盐缓冲溶液中，配制成10mg/ml的溶液，外延栅极浸泡12h，用大量的去离子水冲洗，除去物理吸附的bsa，在au表面形成自组装分子层，附图2为循环伏安曲线表征表面修饰结果。参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂丝电极，制备的外延栅极为工作电极。电解质溶液为5mm[fe(cn)6]
3-/4-，1m kcl，扫描范围为-0.2v～0.6v，扫描速率为0.02v/s。通过附图2可以明显看出，在经bsa修饰后，峰电流明显降低，这是由于bsa阻碍了au表面的电子转移过程，表明bsa成功负载于外延栅极。
[0049]
步骤(3)制备pdms样品池
[0050]
将a胶：b胶按照10：1质量比均匀混合，放入真空干燥箱中抽真空除去气泡，之后倒入盛有模具的容器中，在真空干燥箱中90℃固化40min，剥离模具，切割多余部分制得样品池，利用pdms与au的粘附力可固定于修饰后的外延栅极上。
[0051]
三、本发明制备的传感器在实时检测手性色氨酸分子中应用，具体检测方法如下：
[0052]
步骤(1)手性色氨酸分析液的配制
[0053]
将0.0041g d-，l-色氨酸分别溶于20ml0.1mm pbs缓冲溶液中，配制成1mm标准溶液，依次按比例稀释，将d-，l-色氨酸配成不同浓度标准溶液，浓度为0，100nm，1μm，10μm。
[0054]
步骤(2)器件转移特性曲线测试
[0055]
mos管源极、漏极以及修饰后的外延栅极接入源表，mos管栅极与外延栅极通过导
线相连，反复测试转移特性曲线3次，附图3为转移特性曲线稳定性测试图，可看出本发明搭建的实时测试平台性能稳定，可用于对映异构体分析液后续的实时传感测试。
[0056]
步骤(3)实时基线测试
[0057]
将源表测试栅压设置为1.5v，源漏电压设置为1.5v，向样品池中加入30μl空白0.1mm pbs缓冲液，获得的实时漏极电流曲线作为基线i0。
[0058]
步骤(4)手性色氨酸的实时检测
[0059]
将30μl浓度按照0，100nm，1μm，10μm变化的d-，l-色氨酸依次连续加入样品池中。源表栅极电压设定为1.5v，源漏电压设定为1.5v，测试mos管漏极电流i随浓度的变化。用mos管漏极电流变化量(i-i0)评估传感器对不同浓度的手性色氨酸溶液实时感测结果，如附图4所示，可以看出修饰牛血清白蛋白后，随分析物浓度的增大，漏极电流呈现有规律的阶梯变化趋势。由附图5可以看出，在分析液浓度低至pm级别时，该检测平台依然可实现对色氨酸的手性区分，实现了低压下对低浓度范围手性色氨酸分子的检测，灵敏度明显高于电化学等测试方法。总之，当分析液浓度按梯度变化时，电流变化量(i-i0)呈梯度下降，且l-trp引起的电流变化量更明显，变化率为-10％～-40％，说明l-trp与牛血清白蛋白的作用力更强，结果表明牛血清白蛋白手性微环境在手性对映异构体的区别响应方面起着重要作用，所构建的实时分析平台可以依据不同构型引起的电流变化量大小实现对手性分子的识别。
[0060]
实施例2
[0061]
一、牛血清白蛋白修饰的外延栅极场效应晶体管传感器具体结构同实施例1。
[0062]
二、外延栅极的制备，包括以下步骤：
[0063]
步骤(1)外延栅极的制备
[0064]
将玻璃片长改为2cm，宽改为1.5cm，高改为0.3cm，超声清洗时间改为10min，乙醇煮沸时间改为10min，au薄膜厚度改为90nm，蒸镀速率改为其余过程同实施例1。
[0065]
步骤(2)修饰外延栅极
[0066]
将bsa浓度改为1mg/ml，浸泡时间改为6h，其余具体修饰方法同实施例1。
[0067]
步骤(3)制备pdms样品池
[0068]
pdms样品池具体制备方法同实施例1。其中a胶：b胶改为5：1，温度改为100℃，固化时间改为30min。
[0069]
三、本发明制备的传感器在实时检测手性色氨酸分子中应用，具体检测方法如下：
[0070]
步骤(1)手性色氨酸分析液的配制
[0071]
使用1mm pbs缓冲液，其余方法同实施例1。
[0072]
步骤(3)实时基线测试
[0073]
分析液体积为20μl，将栅压、源漏电压设置为1v，使用1mm pbs缓冲液，其余方法同实施例1。
[0074]
步骤(4)手性色氨酸的实时检测
[0075]
分析液体积为20μl，将栅压、源漏电压设置为1v，使用1mm pbs缓冲液，色氨酸的检测浓度为0，40nm，200nm，1μm，5μm，其余方法同实施例1。
[0076]
实施例3
[0077]
一、牛血清白蛋白修饰的外延栅极场效应晶体管传感器具体结构同实施例1。
[0078]
二、外延栅极的制备，包括以下步骤：
[0079]
步骤(1)外延栅极的制备
[0080]
玻璃片长改为2.5cm，宽改为1cm，高改为0.5cm，超声时间改为30min，乙醇煮沸时间改为30min，au薄膜厚度改为80nm，蒸镀速率改为其余过程同实施例1。
[0081]
步骤(2)修饰外延栅极
[0082]
将bsa浓度改为5mg/ml，浸泡时间改为1h，其余具体修饰方法同实施例1。
[0083]
步骤(3)制备pdms样品池
[0084]
pdms样品池具体制备方法同实施例1，其中a胶：b胶比例改为8：1，固化温度改为20℃，固化时间改为60min。
[0085]
三、本发明制备的传感器在实时检测手性色氨酸分子中应用，具体检测方法如下：
[0086]
步骤(1)手性色氨酸分析液的配制
[0087]
使用10mm pbs缓冲液，其余方法同实施例1。
[0088]
步骤(3)实时基线测试
[0089]
分析液体积为10μl，将栅压、源漏电压设置为2v，使用10mm pbs缓冲液，其余方法同实施例1。
[0090]
步骤(4)手性色氨酸的实时检测
[0091]
分析液体积为10μl，将栅压、源漏电压设置为2v，使用10mm pbs缓冲液，色氨酸的检测浓度为0，800pm，4nm，20nm，100nm，其余方法同实施例1。
[0092]
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。