质谱方法与流程

1.本发明涉及质谱方法和用于执行质谱方法的质谱仪。特别地，本发明涉及数据独立获取(dia)质谱方法和用于执行所述方法的质谱仪。


背景技术：

2.质谱为用于鉴定和定量大有机分子的通常复杂混合物的建立已久的技术。近年来，已经开发允许分析广泛范围的生物和非生物材料的技术，其应用跨越执法、环境、科学研究和生物学的领域。举例来说，在蛋白质组学方面，可分析蛋白质的简单和复杂混合物，其应用于药物发现、疾病鉴定等。
3.包含大量的氨基酸的蛋白质典型地具有相当大的分子量。因此，通过直接质谱测量来准确鉴定和定量蛋白质为具有挑战性的。因此，众所周知，要进行前体样品材料的碎片化。已知各种碎片化技术，其可使不同碎片离子从前体离子产生。此外，所施加的不同碎片化能量可影响碎片化机制。
4.样品分析可大体上分为数据依赖获取(dda)方法和数据独立获取(dia)方法。dda试图确认给定样品中存在一种或多种物质。dda方法鉴定固定数目的前体离子物质，并且经由串联质谱选择和分析那些前体离子物质。可基于强度等级(例如，如通过前体质谱(在下文被称为ms1)中的峰观测到的前十种最丰富的物质)，或通过限定碎片谱(在下文被称为ms2)总是从其获取而无论前体质谱ms1中的峰的强度等级如何的前体质谱峰的包括列表(例如由用户选择)，来确定在dda中哪些前体离子物质为所关注的。
5.相比之下，dia试图确定什么存在于潜在未知特性的样品中。为了确定未知样品分子的分子结构，可提供宽质量范围的ms1扫描和一组ms2扫描的组合。通过使所关注的质量范围(典型地由用户限定)简单地分成区段并且获得每个区段的ms2谱，dia避免dda中必要的决策。在dia的情况下，对ms1前体谱的获取变得或多或少任选，因为前体选择窗口的参数本身携带关于可以的前体离子范围的信息。
6.dia方法对于记录来自样品的大部分信息特别相关，并且可用于目标治疗应用。特别地，dia方法可提供高通量、可重现和敏感的工作流程，用于从基因水平和蛋白质/肽水平分析临床标志物、癌症突变和/或序列变异。这继而有助于理解蛋白质组学研究中的疾病机制，以及提供指导临床决策的额外信息。
7.举例来说，gb 1701857.3(公布为gb 2559395 a)公开一种用于分析样品的质谱的数据独立获取方法。dia方法提供ms1域(即具有前体未碎片化离子)中样品的高分辨率鉴定和定量。由于在ms1域扫描中使用相对高分辨率，因此可以区分具有低质量差异的两种不同样品分子，例如120,000的ms1扫描分辨率能够区分具有大约30ppm(每百万份)质量差异的肽。方法还以相对较低分辨率使用ms2谱循环，以基于对ms1数据的分析来提供对初步鉴定的二次确认。ms1扫描散布在整个ms2扫描中，并且设定ms1重复率(与ms2循环时间无关)，使得在色谱峰上获取足够数量的数据点，用于从色谱峰面积进行准确定量。


技术实现要素：

8.根据本公开的第一方面，提供一种质谱方法。方法包含：
9.a)向样品中添加目标前体的同位素物；
10.b)在同位素物从色谱系统中洗脱时使样品和同位素物发生电离；
11.c)使用数据独立获取(dia)方法质量分析样品，其包含在ms1域中执行质量分析扫描和在ms2域中执行质量分析扫描。
12.在鉴定同位素物从色谱系统中洗脱时，方法另外包含执行目标扫描，所述目标扫描具有目标隔离窗口，所述目标隔离窗口包括在同位素物的色谱峰的持续时间内代表目标前体的质荷比，用于目标前体的鉴定和定量中的至少一个，其中目标扫描被配置成还提供目标分析物的定量数据。目标扫描具有目标隔离窗口，所述目标隔离窗口在dia方法的ms2域中的质量分析扫描的隔离窗口的宽度的数量级优选地更窄，并且优选地小于10da。
13.第一方面的方法执行具有隔离窗口的目标扫描，所述隔离窗口被选择用于目标分析物的鉴定和/或定量。将了解，目标分析物有时可以少量存在于样品中，从而使检测具有挑战性。特别地，对于给定样品，在执行dia方法之前，目标分析物的保留时间可以不是已知的。由于目标分析物可仅以少量存在于样品中，因此使用常规方法确定保留时间具有挑战性。因此，向样品中添加同位素物。同位素物为与其母体分子不同的分子，因为至少一个原子具有不同数量的中子。由于同位素物具有与所关注的目标分析物相同的化学结构，因此同位素物的保留时间将与目标分析物的保留时间相似。然而，由于中子的数量不同，所以可在质量分析扫描中使同位素物与目标分析物区分。
14.因此，除了dia方法的ms1和ms2扫描之外，第一方面的方法还可提供一系列目标扫描。举例来说，目标扫描可在ms1域和/或ms2域中执行。在一些实施例中，目标扫描可包含目标选择离子监测(sim)扫描和/或目标ms2扫描。在鉴定同位素物从色谱系统中洗脱时，执行目标扫描。因此，作为dia方法的一部分，第一方面的方法可提供可适合于鉴定相对低丰度的目标前体的目标扫描。在检测到同位素物时，在通常对应于目标分析物的色谱峰的同位素物的色谱峰的持续时间内执行目标扫描。由于在鉴定同位素物时执行目标扫描，因此可以不显著增加质谱方法的总循环时间的这类方式执行目标扫描。
15.在一些实施例中，目标扫描可包含多次目标ms2扫描和/或多次目标sim扫描。目标ms2扫描为具有包括代表目标分析物的质荷比的目标隔离窗口的所执行的质量分析扫描，其中质量分析扫描在ms2域中执行。目标sim扫描为具有包括代表目标分析物的质荷比的目标隔离窗口的所执行的质量分析扫描，其中质量分析扫描在ms1域中执行。目标扫描(无论是目标ms2扫描还是目标sim扫描)具有数量级约为dia方法的ms2域中的质量分析扫描的隔离窗口的宽度，优选地更窄，并且优选地小于10da、小于8da、小于6da、小于4da或小于2da的目标隔离窗口。
16.在一些实施例中，鉴定同位素物从色谱系统中洗脱包含使用来自ms1扫描的数据来鉴定同位素物洗脱。通过使用ms1扫描来鉴定同位素物，可推断目标分析物从色谱系统中洗脱，从而根据第一方面的方法触发目标扫描。在一些实施例中，鉴定同位素物从色谱系统中洗脱包含使用来自除了ms1扫描之外的ms2域中的质量分析扫描的数据来鉴定同位素物洗脱。
17.在一些实施例中，执行每次目标ms2扫描包含基于目标隔离窗口来质量选择分析
物离子并且使目标隔离窗口内的前体离子碎片化以形成目标碎片化离子，并且质量分析目标碎片化离子。
18.在一些实施例中，每次目标ms2扫描具有包括代表目标分析物的质荷比和代表同位素物的质荷比的目标隔离窗口。由此，可使同位素物离子的ms2质量分析与目标分析物的ms2质量分析组合。目标隔离窗口可有效地为包括代表目标分析物的质荷比和代表同位素物的质荷比的连续的隔离窗口。由此，可提供单个质量隔离窗口，以质量选择代表目标分析物和同位素物的两种离子。可使质量选择的目标分析物和同位素物离子一起碎片化，以提供目标碎片化离子和同位素物碎片化离子，然后对其一起进行质量分析。
19.在一些实施例中，在鉴定同位素物从色谱系统中洗脱时，方法另外包含执行具有同位素物隔离窗口的同位素物扫描，所述同位素物隔离窗口包括在同位素物的色谱峰的持续时间内代表同位素物的质荷比，用于定量同位素物。同位素物扫描可包含以下中的至少一个：多次同位素物sim扫描和多次同位素物ms2扫描。因此，根据第一方面的方法可提供可表征目标分析物的色谱峰的多次目标扫描和可表征同位素物的色谱峰的多次同位素物扫描。由此，根据第一方面的方法可在色谱峰的持续时间内为目标前体和同位素物中的每一个建立校准曲线。建立目标分析物和同位素物的校准曲线可用于提供目标分析物和/或同位素物的另外的鉴定和定量。
20.在一些实施例中，向样品中添加目标分析物的同位素物包含向样品中添加第一量的具有第一质量的目标分析物的第一同位素物，以及向样品中添加第二量的具有第二质量的目标分析物的第二同位素物，分别不同于第一量和第一质量的第二量和第二质量不同。第一和第二量为已知的，并且因此可提供样品中第一和第二同位素物的已知浓度。在鉴定第一或第二同位素物中的至少一种从色谱系统中洗脱时，方法包含执行具有包括代表第一同位素物的质荷比的第一同位素物隔离窗口的多次第一同位素物扫描，执行具有包括代表第二同位素物的质荷比的第二同位素物隔离窗口的多次第二同位素物扫描，和从第一同位素物扫描、第二同位素物扫描和目标扫描产生定量校准。多次第一同位素物扫描和多次第二同位素物扫描可各自包含同位素物ms2扫描和/或同位素物sim扫描。将了解，在第一和第二同位素物扫描中的碎片的峰强度将反映向样品中添加的第一和第二同位素物的不同量。因此，第一和第二同位素物可用于建立质谱方法的校准曲线。可使来自第一和第二同位素物扫描的数据与目标扫描数据组合以确定对目标分析物的定量校准，并且因此以改进的准确度定量目标分析物。
21.在一些实施例中，执行每次同位素物ms2扫描包含基于同位素物隔离窗口质量选择前体离子，并且使同位素物隔离窗口内的前体离子碎片化以形成同位素物碎片化离子；和质量分析同位素物碎片化离子。
22.在一些实施例中，每次目标扫描的隔离窗口可不同于每次同位素物扫描的隔离窗口。将了解，目标分析物离子的质荷比将不同于同位素物离子的质荷比。因此，可为同位素物离子和目标离子提供不同的隔离窗口，以便确保相应的目标扫描和同位素物扫描为选择性的。举例来说，通过提供选择性目标ms2扫描和同位素物ms2扫描，可改进质谱方法的灵敏度和准确度。
23.在一些实施例中，执行的每次目标ms2扫描可与相应的同位素物ms2扫描多路复用。由此，由目标ms2扫描的目标隔离窗口选择的离子可与使用相应的同位素物ms2扫描的
同位素物隔离窗口选择的离子组合。然后可使组合的离子碎片化，并且在单次质量分析扫描中一起进行质量分析。目标ms2扫描和同位素物ms2扫描的这类多路复用可另外减少质谱方法的循环时间。
24.在一些实施例中，使目标ms2扫描与同位素物ms2扫描多路复用包含：使每次目标ms2扫描的目标隔离窗口内的前体离子与在同位素物隔离窗口内的前体离子组合以形成多路复用的前体离子，使多路复用的前体离子碎片化以形成多路复用的碎片化离子，和质量分析多路复用的碎片化离子。目标隔离窗口内的前体离子可与离子存储装置中的同位素物隔离窗口内的前体离子组合，并且作为多路复用的前体离子存储在所述离子存储装置中。可例如通过使多路复用的前体离子喷射到碎片化装置(如碰撞池)中来使多路复用的前体离子碎片化以形成多路复用的碎片化离子。在一些实施例中，使目标ms2扫描与同位素物ms2扫描多路复用包含：使每次目标ms2扫描的目标隔离窗口内的前体离子碎片化以形成目标碎片化离子，使同位素物隔离窗口内的前体离子碎片化以形成同位素物碎片化离子，使目标和同位素物碎片化离子组合以形成多路复用的碎片化离子，和质量分析多路复用的碎片化离子。在质量分析多路复用的碎片化离子之前，可使多路复用的碎片化离子组合并且存储在离子存储装置中。
25.在一些实施例中，每次目标sim扫描可与同位素物sim扫描多路复用。在一些实施例中，使目标sim扫描与同位素物sim扫描多路复用包含使每次目标sim扫描的目标隔离窗口内的前体离子与在同位素物隔离窗口内的前体离子组合以形成多路复用的前体离子，和质量分析多路复用的前体离子。
26.在一些实施例中，目标扫描在整个dia方法中在同位素物的色谱峰的持续时间内交织。在一些实施例中，同位素物扫描可在整个dia方法中在同位素物的色谱峰的持续时间内交织。由此，目标扫描可分布在通常对应于目标分析物的色谱峰的同位素物的色谱峰的持续时间内。在一些实施例中，目标分析物和同位素物的色谱峰可具有相同的形状和时间。在一些实施例中，较重分子的色谱峰可滞后于较轻分子的色谱峰。滞后量可在执行质谱方法之前确定并且加以考虑。在许多情况下，滞后量相对不显著，使得同位素物色谱峰的持续时间的很大一部分(例如至少50％)与目标分析物色谱峰的持续时间重叠。举例来说，了解目标分析物的定量的滞后可有助于改进目标扫描的调度以更紧密地对应于目标分析物的色谱峰。
27.在一些实施例中，目标扫描和/或同位素物扫描在整个dia方法中以不大于2秒的间隔交织。在一些实施例中，每个色谱峰执行至少6次目标扫描以便获得目标分析物的更准确的定量数据。
28.在一些实施例中，每次目标ms2扫描的目标隔离窗口不大于5da。在一些实施例中，每次同位素物ms2扫描的同位素物隔离窗口不大于5da。在一些实施例中，目标隔离窗口和/或同位素物隔离窗口可不大于4da、3da或2da。在一些实施例中，目标分析物离子的目标隔离窗口可取决于目标分析物离子的质荷比，其中具有较高电荷的目标分析物离子可具有较窄的隔离窗口。通过提供相对窄的隔离窗口，其它前体离子可从额外ms2扫描中排除。这继而可改进ms2谱中目标分析物/同位素物离子的信噪比。此外，从额外ms2扫描中排除其它前体离子可简化目标ms2扫描数据的后续分析。
29.在一些实施例中，使用数据独立获取(dia)方法质量分析样品包含执行前体离子
的多次ms1扫描；和执行前体离子的多次ms2扫描。技术人员已知各种dia方法。将了解，除了dia方法的扫描之外，还将执行额外ms2扫描(目标ms2扫描和/或同位素物ms2扫描)。通常可对所关注的前体质量范围的不同质量范围区段或隔离窗口各自执行dia方法的ms2扫描，使得dia方法的一组ms2扫描覆盖所关注的前体质量范围。dia方法和第一方面的方法可在被配置成执行dia获取的任何已知质谱仪上执行。特别地，第一方面的方法可在包含轨道捕集质量分析器的质谱仪、包含两个质量分析器的串联质谱仪等上执行。
30.在一些实施例中，使用dia方法质量分析样品包含；
31.为待分析的样品选择所关注的前体质量范围；
32.执行多次ms1扫描，ms1扫描中的每一次包含：
33.使用在m/z＝200amu下以至少50,000的第一、相对较高分辨率操作的质量分析器在整个所关注的前体质量范围内质量分析前体离子，用于在整个所关注的前体质量范围内的ms1域中鉴定和/或定量样品；和
34.通过以下方式执行一组ms2扫描：
35.使所关注的前体质量范围分段成多个前体质量范围区段，其中
36.对于每个前体质量范围区段：
37.使质量范围区段内的前体离子碎片化，和
38.用以第二、相对较低分辨率操作的质量分析器执行碎片化的质量范围区段的ms2扫描，使得在整个所关注的前体质量范围内的碎片化的样品区段中的每一个被碎片化并且在ms2域中被扫描，
39.其中在整个ms2扫描组中的每一组的执行中交织ms1扫描的执行，使得ms1扫描提供样品的质量色谱图。
40.在gb 2559395 a中公开这类dia方法，并且在其中描述方法的另外细化。gb 2559395 a的全部内容以引用的方式并入本文中。
41.根据上面讨论的dia方法，在整个所关注的前体质量范围内执行前体离子的多次ms1扫描，使得每次ms1扫描都适合于在整个所关注的整个前体质量范围内的ms1域中定量和/或鉴定样品。由此，应当理解，ms1扫描中的每一次跨越基本上全部所关注的前体质量范围延伸。使用以第一、相对较高分辨率操作的质量分析器执行ms1扫描用于在整个所关注的质量范围内的ms1域中定量样品。由此，质量分析器的相对高分辨率是为了在ms1扫描中降低或最小化并且最优选地消除来自基质或其它样品离子的干扰，从而允许在ms1域中鉴定和定量前体样品离子所选择的分辨率。以至少50,000的分辨率执行相对高分辨率的ms1扫描以便充分区分具有相似质量的前体离子，使得可在ms1域中执行准确定量和/或鉴定。
42.根据上述dia方法，可多次执行ms1扫描，与一组ms2扫描的执行交织。由此，在整个一组ms2扫描的执行中多次重复ms1扫描，以便在色谱峰的持续时间内重复采样ms1域中的前体离子。多次ms1扫描和至少一组ms2扫描(但优选地不超过两组)在基于色谱峰的宽度(例如，fwhm)的时间段内执行。在一些实施例中，执行的ms1扫描的数量为执行的ms2扫描组的数量的至少两倍或至少三倍。因此，ms1扫描在样品从色谱系统中洗脱时提供样品的质量色谱图。优选地在一组ms2扫描的持续时间内执行ms1扫描至少3次，更优选地至少5次，并且最优选地至少7次。通过多次重复ms1扫描，可建立前体离子的更准确定量。由此，可重复ms1扫描，以便多次采样前体离子。
43.在一些实施例中，用于执行ms1和ms2扫描中的至少一个的质量分析器为轨道捕集质量分析器。有利的是，通过在使用相对紧凑的质量分析器的同时使用轨道捕集质量分析器，可以相对高分辨率执行ms1扫描并且可以相对低分辨率执行一组ms2扫描。
44.在一些实施例中，轨道捕集分析器用于以至少50,000的分辨率执行形成dia方法的一部分的ms1扫描，以便提供ms1域中的前体离子的改进的定量。举例来说，根据本发明的轨道质量捕集分析器的相对高分辨率可为至少100,000，并且相对低分辨率(用于ms2扫描)可小于60,000，或小于50,000，或小于40,000，更优选地小于30,000。在一些实施例中，小于20,000，或小于15,000，或小于10,000(例如7,500)的ms2扫描的分辨率可为足够的，从而使得能够使用更窄的质量范围区段，这辅助验证前体离子的鉴定/定量。因此，轨道捕集质量分析器可在本发明方法中用于最佳化ms1扫描的分辨率以定量前体离子，同时最佳化ms2扫描的分辨率以验证前体离子的定量。
45.尽管轨道捕集质量分析器可用于以至少100,000的相对高分辨率执行ms1扫描，但是技术人员将了解，分辨率为至少100,000的其它质量分析器也可适合在第一方面的方法中使用。举例来说，可使用多反射飞行时间(mr-tof)质量分析器或傅立叶变换离子回旋共振(ft-icr)质量分析器。轨道捕集质量分析器或ft-icr质量分析器的高质量准确度从ms1扫描实现样品鉴定的高可靠性，其中ms2扫描提供鉴定确认。在一些实施例中，质量分析器(例如，轨道捕集质量分析器)可用于以至少120,000，或至少130,000，或至少140,000，或至少150,000的相对高分辨率执行ms1扫描。通过增加ms1扫描的分辨率，改进区分各种样品离子和基质离子的能力，从而改进样品定量的准确度。
46.根据本公开的第二方面，提供一种质谱仪。质谱仪用于对添加目标分析物的同位素物的样品执行数据独立获取质谱。质谱仪包含用于产生多种前体离子的电离源、质量分析器、碎片化设备、质量选择器、被配置成从质量选择器上游分离样品的分子的色谱系统；和控制器。控制器被配置成：
47.促使电离源在样品和同位素物从色谱系统中洗脱时使样品和同位素物发生电离以形成前体离子；
48.促使质谱仪使用数据独立获取(dia)方法质量分析前体离子，其包含在ms1域中执行质量分析扫描和在ms2域中执行质量分析扫描；
49.以鉴定同位素物是否从色谱系统中洗脱，接着控制器另外被配置成
50.促使质谱仪执行多次目标扫描，每次目标扫描具有目标隔离窗口，所述目标隔离窗口包括在同位素物的色谱峰的持续时间内代表目标分析物的质荷比，用于目标分析物的鉴定和定量中的至少一个，其中目标扫描被配置成还提供目标分析物的定量数据。
51.因此，将了解，第二方面的质谱仪可被配置成执行本公开的第一方面的方法。
52.在一些实施例中，质谱仪的控制器可另外被配置成促使质谱仪具有以上概述的第一方面的方法的另外任选的特征中的任一个。
53.根据本公开的第三方面，提供一种计算机程序。计算机程序包含使第二方面的质谱仪执行根据本公开的第一方面的方法的指令。
54.根据本公开的第四方面，提供一种计算机可读介质。计算机可读介质在其上存储有第三方面的计算机程序。
附图说明
55.本发明可以许多方式来实践，并且现将仅借助于实例并且参考附图来描述具体实施例，在所述附图中：
[0056]-图1示出适合于进行根据本公开的实施例的方法的质谱仪的示意性布置；
[0057]-图2示出可根据本公开的实施例执行的dia方法的实例的图式；
[0058]-图3示出质谱方法的另外的图式，其中除了dia方法之外，还执行目标ms2扫描。
[0059]-图4示出可在本公开的实施例中执行的两种另外的dia方法的图式；
[0060]-图5示出可在本公开的实施例中执行的另一种dia方法的图式。
具体实施方式
[0061]
在本公开中，参考质量分析器的分辨率。技术人员将理解本公开中提及的所有分辨率指代在质荷比(m/z)等于200amu(m/z＝200amu)下的质量分析器的分辨率。技术人员将理解在其下指定质量分析器的分辨率的m/z比仅指示在所述m/z值下的质量分析器的分辨率，并且不受限于质量分析器根据本发明的方法所扫描的m/z范围。
[0062]
图1示出适合于进行根据本发明的实施例的方法的质谱仪10的示意性布置。图1的布置示意性地表示来自赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific,inc)的质谱仪的配置。
[0063]
在图1中，待分析的样品(例如从自动进样器)供应到色谱设备，如液相色谱(lc)柱(图1中未示出)。lc柱的一个这类实例为赛默飞世尔科技公司的proswift整体柱，其通过迫使在流动相中携带的样品在高压下通过构成固定相的不规则或球形颗粒的固定相来提供高效液相色谱(hplc)。在hplc柱中，样品分子根据其与固定相的相互作用程度以不同的速率洗脱。
[0064]
可通过使用检测器(例如质谱仪)随时间测量从hplc柱洗脱的样品分子的数量来产生色谱。从hplc柱洗脱的样品分子将被检测为在色谱上的基线测量结果上方的峰。当不同样品分子具有不同洗脱速率时，可检测在色谱上的多个峰。优选地，个别样品峰在时间上与色谱图中的其它峰分开，使得不同样品分子彼此不干扰。
[0065]
在色谱上，色谱峰的存在对应于样品分子在检测器处存在的时间段。由此，色谱峰的宽度等于样品分子在检测器处存在的时间段。优选地，色谱峰具有高斯形状分布，或可假设具有高斯形状分布。因此，可基于根据峰计算的多个标准偏差来确定色谱峰的宽度。举例来说，可基于色谱峰的4个标准偏差来计算峰宽度。可替代地，可基于在峰的最大高度的一半处的宽度来计算峰宽度。本领域中已知的用于确定峰宽度的其它方法也可为合适的。由此，根据本发明的dia方法获取的ms1数据因此提供从柱中洗脱的样品的质量-色谱图。
[0066]
然后，使用处于大气压下的电喷雾电离源(esi源)20电离经由液相色谱因此分离的样本分子。本领域技术人员将了解，可使用其它合适类型的电离源，如大气压化学电离(apci)、热喷雾电离等。然后，样品离子进入质谱仪10的真空室并且通过毛细管25导引到rf-only s透镜30中。离子通过s透镜30聚焦到将离子注射到具有轴向场的弯曲扁平极50中的注射扁平极40。弯曲扁平极50引导(带电的)离子沿弧形路径通过，同时不想要的中性分子(例如夹带的溶剂分子)不沿弧形路径被引导并且丢失。
[0067]
离子门(tk透镜)60位于弯曲扁平极50的远侧端部处并且控制离子从弯曲扁平极
50行进到四极滤质器70下游。四极滤质器70典型地但未必为分段的，并且当以选择模式操作时，其用作带通滤波器，从而允许选择的质荷比或有限的质荷比范围通过，同时排除其它质荷比(m/z)的离子。可操作四极滤质器70以允许相对宽的质荷比范围(例如400-1210amu)的离子通过，特别是对于ms1扫描而言，这对于获取宽范围的质谱图为有用的。
[0068]
然后，离子穿过四极出射透镜/对切透镜布置80并且进入转移多极杆90。转移多极杆90将已滤质离子从四极滤质器70导引到弧形阱(c阱)100中。c阱100具有供应有rf电压的纵向延伸的弧形电极和供应有dc电压以在c阱100的端部提供势垒的端盖电极。结果为势井沿c阱100的弧形纵向轴线延伸。在第一操作模式中，基于c阱设定dc端盖电压，使得从转移多极杆90到达的离子在c阱100的势井中被捕获，所述离子在势井中冷却。离子到c阱中的注射时间(it)确定随后从c阱喷射到质量分析器中的离子数目(离子群)。尽管在图1的质谱仪中使用c阱100，但是在其它实施例中，例如，在使用不同类型的质量分析器的情况下，可使用不同的离子存储装置来代替，例如，具有直线形而不是弧形的电极的线性阱。
[0069]
冷却的离子驻留在朝向势井底部的云端中并且然后从c阱100朝向轨道捕集装置110如由赛默飞世尔科技公司出售的质量分析器正交地喷射。轨道捕集装置110具有偏离中心的注射孔口并且离子通过偏离中心的注射孔口作为连贯的分组注射到轨道捕集装置110中。离子然后通过超对数电场捕集在轨道捕集装置110内，并且在围绕内部电极进行轨道运行时在纵向方向上进行往复运动。
[0070]
在轨道捕集装置110中的离子分组的移动的轴向(z)分量(或多或少)定义为简谐运动，其中在z方向上的角频率与给定离子物质的质荷比的平方根有关。因此，随着时间推移，离子根据其质荷比而分离。
[0071]
在轨道捕集装置110中的离子通过使用图像检测器(图1中未示出)来检测，在离子物质穿过图像检测器时，所述图像检测器产生含有基于所有离子物质的信息的在时域中的“瞬变”。然后，瞬变经受快速傅立叶变换(fft)，从而产生在频域中的一系列峰。根据这些峰，可产生表示丰度/离子强度相对于m/z的质谱。
[0072]
在上述配置中，通过轨道捕集装置110分析样品离子(更具体地说，通过四极滤质器选择的在所关注的质量范围内样品离子的子集)，而无需碎片化。所得质谱被标示为ms1。
[0073]
ms2分析(或更一般地，ms
n
)也可通过图1的质谱仪10进行。为了实现此，产生前体样品离子并且将其传输到其中选择次级质量范围的四极滤质器70。离开四极滤质器70的离子被导引通过c阱100到达碎片化室120。在图1的质谱仪10中，碎片化室120为碰撞气体所供应到的较高能量碰撞解离(hcd)装置。施加到碎片化室120的电势使得到达碎片化室120的前体离子具有足够的能量，使得它们与碰撞气体分子的碰撞导致前体离子碎片化成碎片离子。然后碎片离子从碎片化室120喷射返回朝向c阱100，其中碎片离子再次在势井中被捕集并且冷却。最后，将在c阱中捕集的碎片离子朝向轨道捕集装置110正交地喷射以分析和检测。碎片离子的所得质谱被标示为ms2。
[0074]
尽管在图1中示出hcd碎片化室120，但是替代地可使用采用如碰撞诱导解离(cid)、电子捕获解离(ecd)、电子转移解离(etd)、光解离等的这类方法的其它碎片化装置。
[0075]
图1中碎片化室120的“盲端”配置(其中前体离子在第一方向上朝向碎片化室120从c阱100轴向地喷射，并且所得碎片离子在相反的方向上返回到c阱100)另外详细描述于wo-a-2006/103412中。
[0076]
质谱仪10处于控制器130的控制下，所述控制器130例如被配置成控制捕集组件的喷射定时，在四极等的电极上设定适当的电势以便聚焦和过滤离子，从轨道捕集装置110捕获质谱数据，控制ms1和ms2扫描的序列等。将了解，控制器可包含可根据计算机程序操作的计算机，所述计算机程序包含用于使质谱仪执行根据本发明的方法的步骤的指令。当然，在其它实施例中，质谱仪可包含以“飞越”配置布置的碎片化室，其中碎片化离子通过碎片化室行进到另外的质量分析器，如线性离子阱，用于ms2分析。举例来说，来自赛默飞世尔科技公司的fusion lumos tribrid质谱仪包含这类“飞越”碎片化室。
[0077]
应当理解，图1中所示的组件的具体布置对于随后描述的方法不是必要的。实际上，用于执行本发明的实施例的dia方法的其它布置为合适的。举例来说，可使用多反射飞行时间(mr-tof)质量分析器或傅立叶变换离子回旋共振(ft-icr)质量分析器代替轨道捕集质量分析器。
[0078]
现在将参考图2和3描述方法的实施例。
[0079]
待分析的样品含有样品分子，包括至少一种所关注的目标分析物。最初，向待分析的样品中添加所关注的目标分析物的同位素物。同位素物为不同于其母体分子(目标分析物)的同位素标记的分子，因为至少一个原子具有不同数量的中子。在一些实施例中，母体分子可为所关注的目标内源性肽(目标分析物)。这类目标内源性肽可仅以相对低的丰度存在于待分析的样品中(如果根本存在)，从而使得使用常规dia方法进行检测具有挑战性。
[0080]
特别地，对于给定样品，在执行dia方法之前，目标分析物的保留时间可以不是已知的。由于目标分析物可仅以少量存在于样品中，因此使用常规方法确定保留时间具有挑战性。因此，以足以使得同位素物能够通过质量分析容易地检测的量向样品中添加同位素物。在优选实施例中，以足以使得同位素物能够被检测的已知量向样品中添加同位素物。因此，同位素物提供同位素标记的内标。由于同位素物具有与所关注的目标分析物相同的化学结构，因此同位素物的保留时间将与目标分析物的保留时间相似或相同。
[0081]
在一些实施例中，可向样品中添加所关注的目标分析物的多种不同的同位素物。相对于所关注的目标分析物，每种同位素物可具有不同的同位素标记。可以不同的已知量向样品中添加不同的同位素物。
[0082]
可从作为上述的示例性设备的一部分(如图1中所示)的液相色谱(lc)柱供应样品和同位素物。
[0083]
在图2和3的实施例中，可从lc柱供应样品分子和同位素物分子，使得根据本发明的实施例的数据独立获取方法在样品分子和同位素物分子从色谱设备洗脱时获取关于样品分子和同位素物分子的数据。将了解，在实验过程中，根据样品分子和同位素物分子的保留时间，lc柱有时可向质谱仪仅供应样品分子、仅供应同位素物分子或供应样品分子和同位素物分子。在本公开中，参考来自lc柱的样品分子和同位素物分子的供应将被认为包括以上情况中的任一种。
[0084]
根据本公开的方法，质谱仪根据包含ms1扫描和ms2扫描的dia方法分析样品分子和同位素物分子。可根据本公开的实施例执行的各种dia方法对于技术人员为已知的。由此，将了解，本公开的方法和质谱仪不限于任何特定dia方法。
[0085]
举例来说，图2示出可根据本公开的实施例执行的dia方法的一个实例。图2示出dia方法的单个循环。如图2中所示，在水平轴线为时间并且竖直轴线为m/z的情况下，多次
ms1扫描(由竖线表示)和一组ms2扫描(由共同构成一组ms2扫描的点表示)在dia方法(工作流程)的单个循环中执行的。图2中所示的循环包括在大约5.23秒的持续时间内执行一组ms2扫描和多次(三次)ms1扫描。可使用图1中所示的设备(或其它合适的设备)执行ms1扫描。
[0086]
为了执行单次ms1扫描，样品分子和/或同位素物分子从lc柱洗脱，然后使用esi源20电离以形成前体离子。前体离子(样品离子和/或同位素物离子)随后进入质谱仪10的真空室。前体离子以如上所述的方式被导引通过毛细管25、仅rf透镜30、注射扁平极40、弯曲扁平极50并且进入四极滤质器70。四极滤质器70由控制器130控制以根据选择的所关注的前体质量范围过滤前体离子。由滤质器70选择宽的m/z范围或窗口，例如>500m/z单位宽，如400-1200m/z的窗口。在图2的实施例中，ms1扫描的所关注的前体质量范围为400-1210m/z。
[0087]
然后，前体离子穿过四极出射透镜/对切透镜布置80、穿过转移多极杆90并且进入c阱100。可将前体离子从c阱100注射到轨道捕集质量分析器110中。一旦前体离子在轨道捕集质量分析器内部稳定，就通过使用镜像电流检测器检测存在于轨道捕集质量分析器110中的前体离子来执行ms1扫描。对于ms1扫描，轨道捕集质量分析器110中的前体离子的检测可被配置成以相对高分辨率(相对于ms2扫描的分辨率)执行。
[0088]
根据图2的dia方法，在dia循环期间，在所关注的前体质量范围内执行一组ms2扫描。为了对质量范围区段执行单次ms2扫描，使来自lc柱的洗脱分子(根据保留时间可为样品和/或同位素物分子)电离以形成前体离子。前体离子以与ms1扫描相似的方式注射到质谱仪中。用于ms2扫描的前体离子以与用于ms1扫描的样品离子相似的方式前进通过毛细管25、仅rf透镜30、注射扁平极40、弯曲扁平极50并且进入四极滤质器70中。
[0089]
一旦用于ms2扫描的前体离子到达四极滤质器70，就由控制器130控制四极滤质器70以根据被扫描的质量范围区段的相对窄质量范围(相对于所关注的前体质量范围)滤质前体离子。举例来说，在图2的实施例中，每个质量范围区段的质量范围为15th。
[0090]
(过滤的质量区段)前体离子从四极滤质器70穿过c阱100并且流向碎片化室120。
[0091]
在hcd碎片化室120中，高能量前体离子与碰撞气体分子碰撞，这导致前体离子碎片化成碎片离子。由此，碎片离子可包含碎片化样品离子和/或碎片化同位素物离子。然后碎片离子从碎片化室120喷射返回到c阱100中，其中碎片离子被捕集并且冷却。然后碎片离子喷射到以相对较低分辨率操作用于分析(ms2扫描)的轨道捕集质量分析器110中，从而实现更快的扫描速度(更短的瞬变获取时间)。所得的获取的质谱被标示为ms2扫描。
[0092]
根据图2的dia方法，控制器130控制质谱仪10以在所关注的质量范围内执行一组ms2扫描。对于一组ms2扫描，所关注的质量范围分成多个质量范围区段，每个质量范围区段覆盖所关注的质量范围的一部分。对于每个质量范围区段，质谱仪10使质量范围区段内的前体离子破片化，并且对质量范围区段内碎片化的前体离子执行ms2扫描。质谱仪对所关注的质量范围的每个质量范围区段执行ms2扫描，以组成一组ms2扫描。
[0093]
如图2中所示，从所关注的质量范围的下限开始连续执行质量范围区段的ms2扫描。当然，在其它实施例中，形成一组ms2扫描的ms2扫描可以不同顺序执行。举例来说，在一些实施例中，可从所关注的质量范围的上限开始连续执行质量范围区段的ms2扫描，或者在其它实施例中，可以通常随机或伪随机顺序对ms2扫描进行排序。
[0094]
根据实施例，控制器130控制质谱仪10以执行dia循环，所述dia循环包含在所关注
的质量范围内的多个ms1扫描并且还包含一组ms2扫描。
[0095]
对于每次ms1和ms2扫描，电离、过滤、捕集、喷射、碎片化(用于ms2)和分析的各个阶段的定时可由控制器130控制以便最佳化吞吐量。举例来说，可以在轨道捕集质量分析器110中分析前体离子以便获得ms1扫描，同时前体离子的子范围(质量范围区段)已经在碎片化室120中用于在此处碎片化。可替代地，可在c阱100中冷却并且捕集碎片离子，同时在轨道捕集质量分析器110中进行前体离子的分析，使得一旦已经完成前体离子分析，就可将碎片离子注射到轨道捕集质量分析器110中用于获得ms2扫描。在质量分析器110中执行ms1扫描的时间期间，可有可能执行前体离子的质量区段的碎片化，以及将碎片冷却并且捕集在c阱100中以准备注射到质量分析器110中。
[0096]
ms1扫描可在一组ms2扫描的持续时间内重复多次。在一组ms2扫描的持续时间内重复ms1扫描可导致ms1扫描在样品离子的色谱峰的持续时间内重复多次，使得色谱峰在其持续时间内被采样多次。举例来说，在图2的实施例中，ms1扫描在单组ms2扫描的持续时间内执行三次。在一些实施例中，执行ms1扫描，使得样品离子的色谱峰被采样至少3次、5次或7次。跨越色谱峰执行至少一次dia循环。在一些实施例中，跨越色谱峰执行至少两次dia循环。在一些实施例中，跨越色谱峰执行不超过两次的dia循环。有利的是，通过在ms1域中对色谱峰多次采样，增加在峰上的数据点的数量，从而改进色谱峰中前体离子的检测。通过对峰多次采样，可在多次ms1扫描中检测样品峰中的前体离子中的每一种，从而获得更好的定量精度。
[0097]
如图2中所示，在一组ms2扫描的持续时间内执行3次ms1扫描。由此，ms1扫描以大约1.74秒的间隔(约0.57hz的ms1采样速率)重复。跨越400-1,210m/z的所关注的质量范围将用于ms1扫描的分辨率设定为120,000。对于图1的质谱仪，以120,000的分辨率执行的单次ms1扫描的检测时间为约256毫秒。在一些实施例中，质量分析器120中的扫描之间的开销可为大约20毫秒。因此，在图2的方法中执行三次ms1扫描的总持续时间为大约828毫秒。
[0098]
在图2的dia方法中，获取ms2数据用于验证ms1数据，即确认鉴定样品分子。由此，出于定量目的，不需要在色谱峰的持续时间内获得多组ms2数据。因此，可在更长的持续时间内(相对于色谱峰的持续时间以及ms1扫描的扫描间隔)获得一组ms2扫描。如图2中所示，在整个一组ms2扫描的执行过程中交织ms1扫描的执行。在图2中所示的实例中，所关注的质量范围选择为400-1210m/z，并且用于区段中的每一个的质量范围选择为15da。因此，在图2的实施例中，可在单组ms2扫描中执行54次ms2扫描(在图2中未准确示出)。举例来说，在图2中，方法使用如上所述的qhf设备，并且因此可在大约64毫秒的检测时间内以30,000的分辨率获取每次ms2扫描，其中开销大约为16毫秒(总扫描时间大约为80毫秒)。因此，如图2中所示，可用大约5.2秒的循环时间来执行以所需ms1采样速率与多次ms1扫描交织的单组ms2扫描。
[0099]
如所讨论，ms1扫描在ms2扫描之间约每1.74秒交织一次，并且执行与ms1扫描交织的一组ms2扫描的总时间为约5.23秒。在每次ms1扫描之间采样18次ms2扫描。这意味着为了获取一组ms2扫描，整个序列为：ms1(400-1210m/z)、ms2(400-415m/z)、ms2(415-430m/z)、
…
、ms2(655-670m/z)、ms1(400-1210m/z)、ms2(670-685)、
…
、ms2(925-940)、ms1(400-1210m/z)、ms2(940-955)、
…
、ms2(1195-1210)。
[0100]
因此，本公开的实施例的dia方法提供具有高分辨能力(例如120,000)的一系列
ms1扫描，使得ms1扫描可用于定量前体离子。高质量准确度有助于前体鉴定的独特性。碎片化的前体离子的ms2扫描用于验证前体鉴定。由于在ms1域中执行的高分辨率定量，因此在ms2域中不需要相对大量的时间分辨率，并且因此ms2扫描可经最佳化以仅用于验证前体离子的特性。此方法允许已改进灵敏度和选择性的质谱方法的数据独立获取方法。此外，可使用“库自由(library free)”方法在ms1域中执行前体离子的定量，从而降低对获取的数据的后处理的要求。
[0101]
使用无库方法分析dia ms1扫描数据并且定量前体离子的一种方法描述于2015年3月《自然方法(nat methods)》中第258-264页tsou等人的“《dia裁定：用于数据独立获取蛋白质组学的综合计算框架(dia-umpire:comprehensive computational framework for data independent acquisition proteomics)》”中。
[0102]
当然，将了解，dia方法的以上描述仅为dia方法的一个可以的实例。由此，技术人员将了解，本公开不限于以上dia方法，并且dia的其它方法可与以下描述的目标ms2扫描结合使用。
[0103]
举例来说，可使用wei zhang等人的“《在q-ot-qit质谱仪上对hela消化液中的钉齿状肽进行数据独立获取(dia)方法的评估(evaluation of data-independent acquisition(dia)approaches for spiked peptides in hela digest on q-ot-qit mass spectrometer)》”(可在http://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/pn-64122-q-ot-qit-asms2014-pn64122-en.pdf获得)中公开的使用三合一质谱仪(四极-轨道阱-离子阱)的dia方法。在那些方法中，轨道阱质量分析器可用于执行前体离子的ms1扫描，同时线性离子阱可用于执行碎片化离子的ms2分析。如zhang等人所述的dia方法的单个循环的实例在图4中重现。将了解，根据本公开的实施例，可根据这些方法向待分析的样品中添加同位素物，其中在检测同位素物时，可如本文所述执行另外的目标ms2扫描和任选的同位素物ms2扫描。
[0104]
相似地，可使用在us 2018-0350576 a1中公开的dia方法，所述dia方法使用轨道阱质量分析器执行ms1扫描并且使用tof质量分析器执行ms2扫描。例如，图5示出在us 2018-0350576 a1中另外描述的dia方法的重现。将了解，根据本公开的实施例，可根据这些方法向待分析的样品中添加同位素物，其中在检测同位素物时，可如本文所述执行另外的目标ms2扫描和任选的同位素物ms2扫描。
[0105]
除了上述dia方法之外，根据本公开的实施例的方法还试图鉴定同位素物分子何时从色谱系统中洗脱，以便执行额外的目标ms2扫描。
[0106]
在一些实施例中，控制器130可通过分析对应于添加的同位素物离子的已知质荷比的质谱峰的ms1扫描数据来鉴定同位素物离子从色谱系统中洗脱。在一些实施例中，控制器130可通过分析对应于同位素物离子的同位素模式的质谱峰的ms1扫描数据来鉴定同位素物离子洗脱。举例来说，在一些实施例中，由于目标分析物的特性为已知的，所以控制器130可预先提供代表同位素物的肽序列。在给定肽序列的情况下，可模拟理论肽同位素模式的不同电荷状态，例如2+3+和4+。可计算每种电荷状态的理论m/z值。
[0107]
控制器可通过使理论肽同位素模式与ms1数据的质谱峰进行比较来实时(即时匹配)分析ms1扫描数据。当ms1数据的质谱峰在预先确定误差阈值内与理论肽同位素模式匹配时，控制器130确定同位素物(并且因此目标分析物)从色谱设备中洗脱。在一些实施例
中，可使用小于5ppm的预先确定误差阈值(质量误差)。
[0108]
根据图2的实施例，在整个dia方法中重复ms1扫描。因此，ms1扫描可用于鉴定同位素物何时从色谱设备中洗脱。在一些实施例中，可以至少0.5hz的频率执行ms1扫描，以便更准确地确定同位素物何时开始从色谱系统中洗脱。当然，对于其它dia方法，可使用ms2扫描来鉴定同位素物是否从色谱设备中洗脱。由此，将了解，本公开的实施例不限于使用ms1扫描数据来鉴定同位素物。
[0109]
作为额外的确认测试，控制器还可使用一组ms2扫描验证同位素物的存在。将了解，具有代表同位素物的结构如肽序列的控制器可产生同位素物的计算机模拟ms2质谱。此ms2质谱可用于即时匹配或实时搜索。因此，在鉴定ms1扫描数据中的同位素物之后，具有覆盖同位素物的质量范围区段的下一次ms2扫描可产生ms2扫描数据，这可用于确认同位素物的存在。
[0110]
在确定同位素物分子从色谱系统中洗脱时，控制器130可中断形成dia方法的ms1和ms2扫描的序列，以执行一系列目标扫描。执行一系列目标扫描，以便还提供目标分析物的定量数据。在图2和3的实施例中，目标扫描为目标ms2扫描。将了解，在其它实施例中，目标扫描可包含在ms1域中执行的目标扫描，例如目标sim扫描。举例来说，执行的目标扫描可包含一系列目标ms2扫描、一系列目标sim扫描，或一系列目标ms2扫描和目标sim扫描。
[0111]
在图3中所示的实施例中，每次目标ms2扫描具有包括代表目标分析物的质荷比的隔离窗口。控制器130可在同位素物的色谱峰的持续时间内反复中断形成dia方法的ms1和ms2扫描的序列，以执行另外的目标ms2扫描。因此，目标ms2扫描可为目标分析物的鉴定和定量中的至少一个提供目标的额外ms2扫描数据。因此，在确定同位素物分子从色谱系统中洗脱时，与根据形成dia方法的ms2扫描的序列执行的具有包括目标分析物的质荷比的隔离窗口的ms2扫描的数量相比，可在色谱峰的持续时间内执行具有包括目标分析物的质荷比的隔离窗口的更多数量的ms2扫描(目标ms2扫描)。因此，目标ms2扫描可从形成dia方法的ms2扫描的序列中无序地执行。
[0112]
除了以上概述的dia方法的ms1和ms2扫描之外，还执行目标ms2扫描。如上文所讨论，执行目标ms2扫描以便帮助鉴定可仅以相对低的量存在于样品中的目标分析物。因此，这类目标分析物可难以使用常规dia方法检测，因为质谱可被更丰富的物质所掩盖。因此，在本公开的方法中，利用包括目标分析物的隔离窗口来执行目标ms2扫描。执行的目标ms2扫描可为用于鉴定和/或定量特定目标分析物的高度目标扫描(即，尝试排除其它可以的成分，以便改进目标分析物离子的质谱峰的信噪比)。
[0113]
在一些实施例中，执行的目标扫描可包含在ms1域中执行目标扫描。举例来说，在一些实施例中，可执行目标选择离子监测(sim)扫描以便还提供目标分析物的定量数据。举例来说，图1的质谱仪可被配置成在鉴定同位素物从色谱设备中洗脱之后执行额外的目标sim扫描。与目标ms2扫描相似，可使用四极滤质器70质量选择前体离子。四极滤质器70使用包括代表目标分析物的质荷比的目标隔离窗口来质量选择前体离子。然后，可将质量选择的前体离子传输到质量分析器110，用于在ms1域中进行质量分析。
[0114]
对于sim扫描，与用于dia方法的ms2扫描的隔离窗口相比，目标隔离窗口可可相对较窄。在一些实施例中，目标sim扫描可具有包括代表目标分析物离子的质荷比的不大于5th宽的隔离窗口。在一些实施例中，目标隔离窗口的宽度可不大于：4th、3th或2th。目标隔
离窗口可以目标分析物的离子的预期质荷比为中心。与dia方法的ms1扫描相比，使用相对窄的目标隔离窗口，可使用前体离子的更长的离子注射时间来执行目标sim扫描。举例来说，与用于dia方法的ms1扫描的隔离窗口的离子注射时间相比，使用图1中所示的光谱仪，可使用更长的离子注射时间将目标隔离窗口中的前体离子注射到c阱100中。
[0115]
除上述之外，本公开的目标扫描可以各种方式执行，例如，如以下选项中所阐述。
[0116]
第一选项为执行目标扫描，例如使用目标隔离窗口对目标分析物进行目标ms2扫描。与用于dia方法的ms2扫描的隔离窗口相比，目标隔离窗口可相对较窄。由此，在一些实施例中，目标ms2扫描可具有包括代表目标分析物离子的质荷比的不大于5th宽的隔离窗口。在一些实施例中，目标隔离窗口的宽度可不大于：4th、3th或2th。目标隔离窗口可以目标分析物的离子的预期质荷比为中心。与dia方法的ms2扫描相比，使用相对窄的目标隔离窗口，可使用前体离子的更长的离子注射时间来执行目标ms2扫描。举例来说，与用于dia方法的ms2扫描的隔离窗口的离子注射时间相比，使用图1中所示的光谱仪，可使用更长的离子注射时间将目标隔离窗口中的前体离子注射到c阱100和/或碎片化装置120中。
[0117]
在鉴定同位素物离子从色谱系统中洗脱之后，可重复目标ms2扫描。可以至少0.3hz或至少0.5hz的频率或大约与ms1扫描相同的频率执行目标ms2扫描。举例来说，在图3的实施例中，在鉴定ms1扫描100中的同位素物离子之后，目标ms2 130扫描可大约每两秒重复一次。目标ms2扫描130、131、132的频率使得能够更准确地定量目标分析物和测定色谱峰形状。
[0118]
除了执行目标分析物离子的目标扫描之外，方法还可包含执行同位素物离子的同位素物扫描。可执行同位素物扫描以便还获得同位素物的定量数据。可在ms1域或ms2域中执行同位素物扫描。举例来说，同位素物扫描可包含一系列同位素物ms2扫描和/或一系列同位素物sim扫描。
[0119]
在图3的实施例中，可执行同位素物ms2扫描。在这类实施例中，除了以上概述的dia方法的ms1和ms2扫描之外，还执行同位素物ms2扫描。这类同位素物ms2扫描可具有包括代表同位素物离子的质荷比的同位素物隔离窗口。与目标ms2扫描相似，同位素物ms2扫描也可具有不大于5th宽的相对窄的隔离窗口。在一些实施例中，每次同位素物ms2扫描的同位素物隔离窗口的宽度可不大于：4th、3th或2th。同位素物ms2扫描可具有与目标ms2扫描基本相同的隔离窗口。目标ms2扫描和/或同位素物ms2扫描的隔离窗口可比上面概述的dia方法的ms2扫描窄。
[0120]
同位素物ms2扫描可以与目标ms2扫描相似的方式执行。举例来说，对于图1的质谱仪，执行同位素物ms2扫描可包含：使用四极滤质器70质量选择具有在同位素物隔离窗口内的质荷比的前体离子。然后，可将质量选择的前体离子转移到碎片化室120中，其中在同位素物隔离窗口内的前体离子被碎片化以形成同位素物碎片化离子。然后，可使用质量分析器110质量分析同位素物碎片化离子。
[0121]
如图3中所示，在鉴定ms1扫描数据中的同位素物离子之后，也可执行同位素物ms2扫描。同位素物ms2扫描可以至少0.3hz或至少0.5hz的频率执行。在一些实施例中，在鉴定同位素物离子之后，同位素物ms2扫描可约每两秒重复一次。
[0122]
在一些实施例中，可以与目标ms2扫描相同的频率执行同位素物ms2扫描，或在其它实施例中，可以不同的频率执行同位素物扫描。可在目标ms2扫描之前或之后执行同位素
物扫描。可重复目标ms2扫描(和任选的同位素物ms2扫描)，以便获得适合于表征从色谱设备中洗脱的同位素物分子的色谱峰的信息。通过以这类频率重复目标ms2扫描和/或同位素物ms2扫描，可有可能获得适合于表征色谱峰的形状的数据。可重复目标ms2扫描(和任选的同位素物ms2扫描)，直到在ms1扫描数据中不再检测到同位素物离子为止。在其它实施例中，在鉴定ms1扫描数据中的同位素物离子之后，目标ms2扫描(和任选的同位素物ms2扫描)可重复预先确定次数，例如，至少2、3、4、5、6、7或8次，或更多次。
[0123]
在一些实施例中，可以不同的量向样品中添加多种不同的同位素物。举例来说，第一量的第一同位素物具有第一质量、第二量的第二同位素物具有第二质量，其中相应同位素物的量和质量不同。在鉴定同位素物中的至少一种从色谱系统中洗脱时，方法包含：
[0124]
执行具有包括代表第一同位素物的质荷比的第一同位素物隔离窗口的多次第一同位素物ms2扫描；
[0125]
执行具有包括代表第二同位素物的质荷比的第二同位素物隔离窗口的多次第二同位素物ms2扫描；和
[0126]
从第一同位素物ms2扫描、第二同位素物ms2扫描和目标ms2扫描产生定量校准。
[0127]
当然，将了解，在一些实施例中，可向样品中添加多于两种不同的同位素物，随后可在质谱方法期间在ms2域中对其进行分析。因此，可用具有不同m/z的多种不同的同位素物同位素标记目标分析物，但是仍然在与目标分析物相似的时间洗脱。通过在样品中具有带有不同已知浓度的两种或更多种同位素物，可通过同位素稀释分析将定量校准(如校准曲线)确定为质谱方法的一部分。将了解，在本公开的一些实施例中，定量校准可作为后处理步骤的一部分(即，在样品已经完成从色谱设备中洗脱之后)产生。在本公开的其它实施例中，可在产生来自质量分析器的数据时实时产生定量校准。
[0128]
通过独立于目标扫描执行同位素物扫描，可独立于目标分析物离子来分析同位素物离子。这对于增加目标扫描中目标分析物离子信号的准确度和信噪比可为期望的。当然，将了解，目标扫描和同位素物扫描的独立性是以执行额外的同位素物扫描为代价的，这将增加整个循环时间。特别地，对于其中多个目标分析物可部分共洗脱的实施例，执行的额外同位素物扫描的数量可组合地导致循环时间的显著增加。
[0129]
第二选项为执行目标扫描，其中在单次扫描中一起质量分析同位素物离子和目标分析物离子(如果存在)。举例来说，可在ms1域(例如sim扫描)或ms2域(即ms2扫描)中执行单次扫描。在这类目标ms2扫描中，可选择用于质量选择离子的隔离窗口(组合的隔离窗口)以限定包括代表目标分析物离子和同位素物离子的质荷比的连续的质荷比范围。在目标sim扫描中，可选择用于质量选择离子的隔离窗口(组合的隔离窗口)以限定包括代表目标分析物离子和同位素物离子的质荷比的连续的质荷比范围。
[0130]
在一些实施例中，组合的隔离窗口的宽度可不大于8th。在其它实施例中，组合的隔离窗口的宽度可不大于6th或4th。
[0131]
将了解，组合的隔离窗口的宽度可比用于例如上述第一选项的独立目标ms2扫描和同位素物ms2扫描的目标隔离窗口或同位素物隔离窗口宽，这可对目标分析物离子和同位素物离子的信噪比有影响。尽管在一些情况下，用于这类情况的组合的隔离窗口可更宽，但是将了解，相对于第一选项，可减少执行的额外扫描的次数。
[0132]
第三选项为执行与同位素物扫描或多次同位素物扫描(其中向样品中添加目标分
析物的多种不同的同位素物)多路复用的目标扫描。举例来说，目标ms2扫描可与同位素物ms2扫描或多次同位素物ms2扫描(其中向样品中添加目标分析物的多种不同的同位素物)多路复用。目标sim扫描可与同位素物sim扫描或多次同位素物sim扫描(其中向样品中添加目标分析物的多种不同的同位素物)多路复用。
[0133]
对于多路复用的目标ms2扫描，使用对应于目标分析物离子的质荷比的第一隔离窗口质量选择第一组前体离子。第一组前体离子可在离子阱中，例如在图1的质谱仪的c阱100或碎片化室120中存储和/或碎片化。然后，可使用包括代表同位素物离子的质荷比的第二隔离窗口质量选择第二组前体离子。第二组前体离子可与第一组相似地存储和/或碎片化。然后可使第一和第二组前体离子一起碎片化，并且在单次多路复用的ms2扫描中一起质量分析碎片化离子。因此，通过执行多路复用的ms2扫描，使用不同的隔离窗口分别质量选择目标分析物离子和至少一种同位素物离子，并且然后执行单次多路复用的ms2扫描用于分析质量选择的目标分析物离子和至少一种同位素物离子。
[0134]
使目标ms2扫描与同位素物ms2扫描多路复用可允许第一和第二隔离窗口中的每一个相对较窄(与第二选项的组合的隔离窗口相比)。在一些实施例中，第一和第二隔离窗口中的每一个的宽度可不大于5th。在一些实施例中，第一和/或第二隔离窗口的宽度可不大于：4th、3th或2th。将了解，在一些实施例中，第一和第二隔离窗口的宽度可不同。通过为待分析的同位素物离子和目标分析物离子中的每一种提供相对窄的隔离窗口，多路复用的目标ms2扫描和同位素物ms2扫描对于多路复用的ms2扫描可具有相对高的灵敏度和相对高的选择性，与第一选项相似。
[0135]
通过使目标ms2扫描与同位素物ms2扫描多路复用，可以与上文讨论的第二选项相似的方式减少执行的额外ms2扫描的数量。由此，使目标ms2扫描和同位素物ms2扫描多路复用可减少根据本公开的实施例的质谱方法的总循环时间。将了解，使ms2扫描多路复用可允许用不同的隔离窗口质量选择两组或更多组离子，并且在单次ms2扫描中进行组合。由此，根据本公开的多路复用的ms2扫描可在单次ms2扫描中使带有不同质荷比的几种同位素物离子组合。如上文所讨论，在一些实施例中，以不同的量向样品中添加具有不同质量(例如不同数量的中子)的多种同位素物。在鉴定同位素物中的至少一种从色谱系统中洗脱时，可执行多次同位素物ms2扫描。在一些实施例中，可执行同位素物中的每一种的多次同位素物ms2扫描。由此，多次同位素物ms2扫描中的每一次可具有对应于同位素物离子中的一种的相应质荷比的隔离窗口。将了解，每次同位素物ms2扫描的对应碎片峰的强度将反映向样品中添加的同位素物的不同量。定量校准可从同位素物ms2扫描的不同峰强度产生并且基于校准，根据目标ms2扫描中一个或多个峰的强度测定目标分析物的定量。在一些实施例中，可以不同量向样品中添加目标分析物的多种不同质量的同位素物，使得所述同位素物在样品中具有不同的浓度。多种不同质量的同位素物的标称质量或精确质量可不同。
[0136]
可使用多路复用的ms2扫描来分析包括目标分析物的多种同位素物的样品。在一些实施例中，可通过使目标ms2扫描与不同质量的同位素物的多次同位素物ms2扫描多路复用来执行多路复用的ms2扫描。可基本上如上所述执行多路复用的ms2扫描，其中在多路复用的ms2扫描中还包括第三、第四、第五等组前体离子。由于不同质量的同位素物以不同的量或浓度存在，因此可从多路复用的ms2扫描中产生来自同位素物和/或同位素物碎片峰的强度的定量校准曲线，其可用于从单次多路复用的ms2扫描中准确地定量样品中的目标分
析物。
[0137]
可按照与多路复用的目标ms2扫描相似的概念来执行多路复用的目标sim扫描。由此，使用对应于目标分析物离子的质荷比的第一隔离窗口来质量选择第一组前体离子。第一组前体离子可在离子阱中，例如在图1的质谱仪的c阱100或碎片化室120中存储。然后，可使用包括代表同位素物离子的质荷比的第二隔离窗口质量选择第二组前体离子。第二组前体离子可与第一组相似地存储。然后可在单次多路复用的sim扫描中一起质量分析第一和第二组前体离子。因此，通过执行多路复用的sim扫描，使用不同的隔离窗口可分别质量选择目标分析物离子和至少一种同位素物离子，并且然后执行单次多路复用的sim扫描用于分析质量选择的目标分析物离子和至少一种同位素物离子。
[0138]
在第四选项中，可使用实时搜索来即时鉴定同位素物，例如肽。这可通过分析ms1扫描数据的质谱峰来完成，所述质谱峰对应于添加的同位素物离子的已知质荷比或对应于同位素物离子的同位素模式。在鉴定所述同位素物(肽)之后，可触发多路复用dia扫描用于定量。
[0139]
图3描绘可在图1中所示的质谱仪上执行并且举例说明许多上述特征的质谱方法的实施例。
[0140]
在图3中所示的方法的第一步中，基于对含有目标分析物的样品的lc-ms分析，将目标分析物的特性输入质谱仪，并且向样品中添加目标分析物的同位素物。在此实例中，目标分析物为预期存在于样品中的肽序列。在给定肽序列的情况下，使用已知方法，模拟具有和不具有同位素标记的理论同位素模式的肽的不同电荷状态，例如2+3+和4+。可计算每种电荷状态的理论m/z值。
[0141]
在第二步中，当样品从色谱系统中洗脱时，执行前体质量范围为400-1210th的ms1扫描100。关于来自第一步的质谱峰和同位素模式的m/z值的理论前体信息用于使同位素物的理论质谱峰与ms1谱中获取的质谱峰进行即时匹配。基于理论同位素模式，如果例如同位素物同位素模式的峰特征与ms1中检测的特征的准确质量之间的质量误差小于5ppm并且同位素模式匹配优于80％，那么它们可被认为是匹配的。任选地，将匹配特征放置到内部动态监测列表中，用于在含有前体的m/z值的即将进行的ms2 dia扫描中进行连续监测。在图3的实例中，通过匹配从ms1扫描中检测同位素物肽的前体为110m/z 500.5(2+)。
[0142]
在第三步中，根据肽序列信息，可计算机模拟产生理论ms2谱，其用于通过使理论ms2谱与在检测的前体的dia方法中获取的ms2谱进行比较来用于即时匹配或实时搜索。当在第二步的动态列表中针对检测的前体质量(500.5m/z)执行dia ms2扫描120时，将来自其理论ms2谱的检测的同位素物肽的碎片与获取的dia ms2扫描的峰进行比较。
[0143]
在图3的实施例中，形成dia方法的一部分的dia ms2扫描按照从低质荷比到高质荷比的序列执行，随后作为dia方法的一部分对ms1域中的目标分析物进行分析。当然，在其它实施例中，可在ms1扫描之后不久之后(例如立即)优先排序并且执行含有同位素物肽的dia ms2扫描，其中同位素物同位素模式的峰特征与ms1中检测的特征的准确质量可被认为是匹配的。
[0144]
在第四步中，当dia ms2谱与所关注的同位素物肽的理论ms2谱匹配时，确认从ms1扫描中鉴定同位素物肽。ms2匹配标准包括匹配碎片的数量、碎片的质量误差和碎片的电荷状态等中的任一个或全部。然后，对于同位素物肽141和对应的内源性目标肽142两者，使用
单独的隔离窗口141、142(每个2m/z宽)立即触发窄窗口多路复用的目标ms2扫描130。对于同位素物肽离子141的质量选择，将离子注射时间设定为相对较低(例如10毫秒)，因为存在足够的加入同位素物肽的信号。对于内源性目标肽142的质量选择，为了确保定量灵敏度，将离子注射时间设定为相对较高(例如100毫秒)。因此，在碎片化之前，将同位素物和内源性肽的总注射时间设定为与轨道阱质量分析器检测时间(例如128毫秒)大约平行，以有利于占空比速度。
[0145]
在图3的实施例中，作为dia方法的一部分，在分析ms2域中的目标分析物之后，执行多路复用的ms2扫描。当然，在其它实施例中，可在ms1扫描之后不久之后(例如立即)优先排序并且执行目标ms2扫描(例如多路复用的ms2扫描)，其中同位素物同位素模式的峰特征与ms1中检测的特征的准确质量可被认为是匹配的。
[0146]
在第五步骤中，在第一多路复用的目标ms2扫描130之后，根据dia方法继续dia扫描。如图3中所示，dia方法包含多次ms2扫描100、101、102、103和至少一组ms2扫描150。为了确保良好的定量精度，对于同位素物和内源性肽141、142，从跨越色谱峰触发的多路复用的目标ms2扫描130、131、132中获取内源性肽的至少7-8个数据点。因此，基于约16秒的肽的典型色谱峰宽度，每2秒重复同一对同位素物和内源性肽的多路复用的目标ms2扫描，直到在ms1全扫描中不再检测到同位素物肽或获取固定数量的多路复用的扫描的最后一次多路复用的ms2扫描。
[0147]
如上所述，在本公开的一些实施例中，可在ms1扫描之后不久之后(例如立即)优先排序并且执行含有同位素物肽的dia方法的dia ms2扫描，其中同位素物同位素模式的峰特征与ms1中检测的特征的准确质量可被认为是匹配的。此外，在一些实施例中，可在ms1扫描之后不久之后(例如立即)优先排序并且执行目标ms2扫描(例如多路复用的ms2扫描)，其中同位素物同位素模式的峰特征与ms1中检测的特征的准确质量可被认为是匹配的。由此，将了解，在一些实施例中，可通过修改dia方法的ms2扫描来执行目标ms2扫描。为了使目标ms2扫描还提供目标分析物的定量数据，相对于dia方法的未修改的dia ms2扫描，目标ms2扫描可具有增加的注射时间和/或更窄的目标隔离窗口。由此，在此实施例中，可通过修改dia方法的调度ms2扫描来执行目标ms2扫描。在其它实施例中，除了dia方法的调度扫描之外，还可执行目标扫描(即，额外的目标ms2扫描和/或额外的目标sim扫描)。
[0148]
因此，本公开的实施例可用于提供遵循dia方法的质谱方法，同时还允许目标鉴定和/或定量预先鉴定的一种或多种目标分析物。质谱方法特别适合于鉴定和/或定量低丰度的一种或多种目标分析物。特别地，本公开的方法和实施例可与基于高分辨率ms1的定量dia工作流程组合，所述工作流程可提供比本领域中先前所做的方法更高的鉴定置信度和更好的定量精度。本发明在例如基因突变检测、基因组和/或蛋白质组测序、癌症预后和/或诊断测试、已知临床标记物检测和定量以及药物反应测试的领域中为有益的。