一种植物节水抗旱功能的鉴定方法

1.本发明涉及一种植物节水抗旱功能的鉴定方法，属于农业生物技术领域。


背景技术：

2.全球气候变暖和水资源短缺导致的干旱是目前农业生产面临的主要问题， 我国农业生产所需的水量较大，农业用水占全国总用水量的三分之二。因此植 物尤其是农作物的节水抗旱问题一直深受社会关注。节水和抗旱是两个不同但 又相互联系的概念。植物节水是指植物生长发育过程中有效利用水分，降低耗 水，具有较高水分利用效率的能力。植物抗旱可以分为三个方面：避旱性、耐 旱性和复原抗旱性。节水抗旱是指植物通过减少水分散失，降低耗水，保存水 分，避免或延迟植株遭受干旱，与抗旱中的避旱相似。节水抗旱作物在适度干 旱缺水或阶段性干旱时能通过节水，降低耗水，保存水分避免干旱，保证植株 正常生长，恢复浇水后产量不受影响。减少水分散失是植物节水抗旱的重要环 节。蒸腾是植物耗水的主要途径，气孔蒸腾是植物叶片蒸腾的主要形式。植物 可以通过调节气孔开闭，控制气孔蒸腾，调节水分的利用。
3.相较于经典抗旱研究，节水抗旱概念提出较晚。国际上从1972年提出抗旱性划分，到1999年才开始联合评价抗旱与水分利用效率，直至2004年才提出节水与抗旱。植物的节水抗旱性状非常复杂，涉及多个重要的生理范畴，目前节水抗旱研究中超过98%的文章集中在栽培和育种领域，这些研究改进了节水抗旱栽培技术，获得了节水抗旱作物品种；但在节水抗旱基因的挖掘，基因功能鉴定、机理和分子机制方面的研究还很少，虽然发现与蒸腾相关基因，但是并没有系统探索基因的节水抗旱功能。
4.目前的植物节水抗旱功能鉴定主要从栽培育种方面进行，费时费力。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种植物节水抗旱功能的鉴定方法，能够从遗传和生理两方面鉴定植物苗期节水抗旱功能。为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：本发明提供了一种植物节水抗旱功能的鉴定方法，所述方法包括如下步骤：选取同一批次已催芽的植物种子培养至特定生长阶段，选取特定生长阶段的植物进行表型鉴定；根据表型鉴定结果，动态评价节水抗旱功能；其中，所述培养至特定生长阶段包括：实验室水培至幼苗期、实验室土培至幼苗期和田间培养至分蘖期；其中，所述表型鉴定包括：对实验室水培幼苗进行蒸腾表型鉴定、对实验室土培幼苗进行干旱表型鉴定、对田间分蘖期幼苗进行生理表型鉴定。
6.进一步地，所述动态评价节水抗旱功能包括：根据实验室水培幼苗的蒸腾表型鉴定，初步评价节水抗旱遗传表型；
根据实验室土培幼苗的干旱表型鉴定，长期验证节水抗旱遗传表型；根据田间分蘖期幼苗的生理表型鉴定，实时检测节水抗旱生理表型。
7.进一步地，对实验室水培幼苗进行蒸腾表型鉴定的方法为：将不同株系幼苗种植在大小合适的小板上，每板间隔种植相同且一定棵数的幼苗，单独放置在11.5
×
8.5
×
18cm的透明方盆内，加满营养液并称重；在光照足够恒温30℃恒湿60%的培养箱内放置3天，正常培养，观察透明方盆内水位变化，以黑线标记水位，同时称重；每个株系至少进行三次生物学重复；计算能够用于初步评价节水抗旱遗传表型的耗水量，计算公式为：耗水量=0天营养液重量-3天后营养液重量。
8.优选地，培养至少三组小板的水培幼苗进行蒸腾表型鉴定，以保证至少进行三次生物学重复。
9.进一步地，对实验室土培幼苗进行干旱表型鉴定的方法为：将不同株系幼苗种植在含有相同重量土的10
×
10
×
8.5cm小盆内，每小盆间隔种植相同且一定棵数的幼苗，水饱和后，每株系各六小盆单独放入一个大小合适且封闭的32
×
23
×
8.2cm蓄水盘中，加入相同体积的水，在光照足够恒温30℃恒湿60%的培养箱内培养，每天连续称重，同时不再浇水，进行干旱胁迫；加水恢复培养，并统计存活率；每个株系至少进行三次生物学重复；计算能够用于长期验证节水抗旱遗传表型的每盆苗土壤含水量，计算公式：土壤含水量=（烘干前小盆和蓄水盘及土样质量-烘干后小盆和蓄水盘及土样质量）/（烘干前小盆和蓄水盘及土样质量-烘干空小盆和蓄水盘质量）*100%。
10.优选地，每个株系培养至少三组小盆的土培幼苗进行干旱表型鉴定，以保证至少进行三次生物学重复。
11.进一步地，所述水饱和的步骤为：将每小盆苗浸没在水中吸收足够水分后，同时沥干，直到每小盆苗不再滴水，再将其放入干燥的蓄水盘中。
12.进一步地，对田间生长期幼苗进行生理表型鉴定包括：气孔导度、蒸腾速率、光合作用效率、叶面温度及气孔观察。
13.进一步地，对田间生长期幼苗进行生理表型鉴定的环境为：6-8月晴天上午9:00-11:00或光照足够且恒温30℃恒湿60%的温室。
14.进一步地，对田间生长期幼苗进行生理表型鉴定时每个株系选取10株及以上长势一致、生长状态良好的相同部位叶片进行测量及气孔观察取样。
15.进一步地，所述测量及气孔观察取样包括：采用环境扫描电子显微镜对叶片气孔进行扫描观察、拍照，统计气孔开度、密度及长度，每个株系至少统计三百个气孔。
16.进一步地，对田间生长期幼苗进行生理表型鉴定时叶片进行测量及气孔观察取样的时间小于一分钟。
17.与现有技术相比，本发明实施例所提供的一种植物节水抗旱功能的鉴定方法所达到的有益效果包括：本发明对实验室水培幼苗进行蒸腾表型鉴定初步评价节水抗旱遗传表型、对实验
室土培幼苗进行干旱表型鉴定长期验证节水抗旱遗传表型、对田间生长期幼苗进行生理表型鉴定实时检测节水抗旱生理表型，从遗传和生理两个角度系统地、动态地评价鉴定植物苗期的节水抗旱表型，在小范围内就能能够准确地反应植物的节水抗旱功能，省时省力，同时方便对基因功能鉴定、机理和分子机制进行研究，因此对于缓解水资源危机，发展节水农业，抵御干旱，保障国家的粮食安全、生态安全和社会可持续发展具有重要意义。
附图说明
18.图1是本发明提供的一种植物节水抗旱功能的鉴定方法的流程图；图2是本发明实施例1提供的的蒸腾表型鉴定中ospil15过表达及敲除株系与野生型的对照图；图3是本发明实施例2提供的干旱表型鉴定中ospil15过表达及敲除株系与野生型的对照图；图4是本发明实施例3提供的生理表型鉴定中ospil15过表达与敲除株系和野生型的气孔导度、蒸腾速率、光合作用效率、叶面温度的对照图；图5是本发明实施例3提供的生理表型鉴定中ospil15过表达与敲除株系和野生型的生理表型的气孔观察的对照图。
具体实施方式
19.下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
20.本发明的实施例均采用日本晴野生型水稻作为对照，ospil15过表达及敲除株系的日本晴作为实验材料。
21.实施例1：本发明实施例提供了一种植物节水抗旱功能的鉴定方法的蒸腾表型实施方法。
22.步骤1：选择野生型（wt）和ospil15过表达材料（oe5，oe6，oe10）以及敲除材料（15-2，15-3）培养至四叶一心期。
23.步骤2：分别选取长势一致的四叶一心期的野生型（wt）和ospil15过表达材料以及敲除材料各45株。将不同水稻株系放置在相同大小的透明方盆内，加满营养液后，在培养箱内放置3天，28℃正常培养，观察透明方盆内水位变化并以黑线标记水位，对野生型（wt）和过表达及敲除材料蒸腾表型进行拍照分析。结果如图2a和b所示，ospil15过表达株系的水位高于野生型对照，表明ospil15过表达株系的蒸腾速率低于野生型对照；ospil15突变体株系则相反。结果显示ospil15影响水稻的蒸腾速率，表明ospil15可能具有节水抗旱功能。
24.步骤3：在加满营养液的当天和三天后相同时间段内分别对各个株系进行称重实验，计算其耗水量，结果如图2c所示，ospil15过表达株系的耗水量明显低于野生型对照，敲除株系则相反，进一步表明ospil15的节水抗旱功能。
25.实施例2：本发明实施例提供了一种植物节水抗旱功能的鉴定方法的干旱表型实施方法。
26.步骤1：选择野生型（wt）和ospil15过表达材料（oe5，oe6，oe10）以及敲除材料（15-2，15-3）培养至四叶一心期，每个株系12棵苗，种在相同的小方盆内。
27.步骤2：分别选取长势一致的四叶一心期的野生型（wt）和ospil15过表达材料以及敲除材料土培苗，水饱和后每株系共六小盆单独放入一个封闭的蓄水盘，加入相同体积的水，每天连续称重，同时不再浇水，进行干旱胁迫。
28.步骤3：干旱胁迫六天后，加水恢复培养，并统计存活率，结果如图3a和b所示，在干旱胁迫5天后，野生型植株的叶片开始出现萎蔫现象；而过表达植株大部分叶片仍未萎蔫，保持伸展状态；但敲除植株已表现出严重的萎蔫现象。重新浇水10天后野生型大部分植株死亡，只有少数植株存活；过表达植株基本上都能恢复至干旱胁迫前生长状态；而敲除植株基本上全部死亡；同时统计存活率也发现，过表达植株存活率极显著高于野生型，敲除则相反。与之前的蒸腾表型结果相同，进一步表明ospil15的节水抗旱功能。
29.步骤4：计算各株系的土壤含水量，计算公式：土壤含水量=（烘干前小盆和蓄水盆及土样质量-烘干后小盆和蓄水盆及土样质量）/（烘干前小盆和蓄水盆及土样质量-烘干空小盆和蓄水盆质量）*100%，结果如图3c所示，ospil15过表达三个株系的土壤含水量高于野生型对照，而敲除株系的土壤含水量低于野生型对照，进一步表明ospil15影响水稻蒸腾。
30.实施例3：本发明实施例提供了一种植物节水抗旱功能的鉴定方法的生理表型实施方法。
31.步骤1：选择野生型（wt）和ospil15过表达材料（oe5，oe6，oe10）以及敲除材料（15-2，15-3），田间培养至五叶一心期。
32.步骤2：采用便携式光合仪li-6400 （li-cor inc, lincoln, nebraska, 美国），于晴天上午9:00-11:00测定野生型（wt）、ospil15过表达及敲除株系心叶旁第一片展开叶的气孔导度、蒸腾速率和光合作用效率。每个株系选取10株长势一致、生长状态良好的叶片进行测量，各进行三次重复。通过光合速率及蒸腾速率计算水分利用效率，水分利用效率计算公式如下：水分利用效率=光合作用效率/蒸腾速率结果显示，如图4a、b、c和d所示，ospil15过表达株系的蒸腾速率、气孔导度均极显著低于对照，过表达株系光合作用效率低于对照或与对照持平，ospil15敲除株系的蒸腾速率、气孔导度和光合作用效率均极显著高于对照。此外，ospil15过表达株系和敲除株系的水分利用效率与野生型相比均没有降低；同时，采用热成像仪flir e40测定转基因水稻和野生型对照的叶面温度，如图4e和f所示，ospil15过表达株系叶的温度极显著高于对照，敲除株系叶的温度极显著低于对照。因为叶片温度越高，蒸腾速率越低；叶片温度越低，蒸腾速率越高，所以，上述结果与ospil15转基因株系观察到的蒸腾表型结果相符，表明ospil15通过降低气孔导度及蒸腾速率，以提高ospil15过表达株系的节水抗旱性。
33.步骤3：相同时间段，固定五叶一心期的野生型及ospil15过表达、敲除株系心叶旁第一片展开叶并制片，接着采用环境扫描电子显微镜观测各株系叶的气孔开度、气孔密度及气孔长度。如图5a所示，我们将水稻的三种气孔形态分为以下三种：完全张开、部分张开和完全关闭，并对三种气孔形态的比率进行统计。如图5b所示，ospil15过表达株系完全张开的气孔低于野生型对照，敲除株系完全张开的气孔高于野生型对照；ospil15过表达株系完全关闭的气孔高于野生型对照，敲除株系完全关闭的气孔低于野生型对照。ospil15过表达及敲除株系部分张开的气孔与野生型对照相比并无显著性差异。此外，如图5c和d所示，ospil15转基因株系及敲除株系的气孔长度、气孔密度与野生型对照相比无显著性差异。上述结果表明ospil15通过影响水稻的气孔开闭，调节蒸腾速率起到节水抗旱功能。
34.上述实施例1-3证明，本发明提供的一种植物节水抗旱功能的鉴定方法从遗传和生理两个角度系统评价了植物苗期的节水抗旱表型，能够准确地反应植物的节水抗旱功能，具有重要意义和广阔应用前景。
35.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。