一种同时检测维生素A、D、E的卷积电流伏安法的制作方法

一种同时检测维生素a、d、e的卷积电流伏安法
技术领域
1.本发明属于维生素检测技术领域，具体涉及一种同时检测维生素a、d、e的卷积电流伏安法。


背景技术：

2.随着社会的进步，人们越来越关注自身健康。作为具有机体重要生理功能的维生素，其合理应用、治疗与诊断性监测也越来越被重视，其中脂溶性维生素a、d、e在调节物质代谢和维持生理功能等方面发挥着重要作用。
3.维生素a可以维持正常视觉功能，维持骨骼正常发育，促进生长和生殖，维生素a的缺乏会导致视紫红质再生变慢，严重时可导致夜盲症，长期缺乏还会导致生长停滞，细胞免疫变差，维生素a过量可能会引起中毒。
4.维生素d为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素，维生素d可促进钙质的吸收，进而使骨质钙化，维持骨骼与牙齿的正常结构，帮助维生素a的吸收。儿童维生素d的缺乏会导致佝偻病，成年人则为软骨症；而当维生素d过量时，则会发生炎症、细胞退化和钙化，其他过量症状包括厌食、体重急剧降、血钙升高和血磷酸等。
5.维生素e能阻断自由基的链式反应，是人体内的抗氧化剂，维生素e与生殖功能有关，能够促进性激素分泌、降低细胞老化、延缓衰老、预防动脉硬化等。维生素e的缺乏会导致生育能力降低、贫血症、肌肉营养不良等，而过量则会引起恶心、呕吐、头痛、视力模糊、皮肤皲裂、口角炎、胃肠功能紊乱。
6.所以维生素a、d、e的定量检测具有重大临床意义，如果能同时检测这三种维生素可大大缩短检测时间，减少样本的使用量，还可以同时分析同一样本维生素a、d、e的含量和相互影响及协同作用。
7.现有的检测维生素a、d、e的方法各有不同，主要有重量法、滴定法、荧光分析法、高效液相色谱法和电化学方法等。重量法和滴定法操作复杂，很难适用于临床常规测定，对低含量组分的测量误差大，如果对终点判断不敏锐会引起较大误差，而且不能对维生素a、d、e进行同时检测；光谱分析法和色谱法的前处理过程过于繁琐耗时，使用较多的有机溶剂，且对血液样品的需要量较多；电化学方法灵敏、快速，对样品需要量少，且不需要进行前处理，特别适合生物样品中维生素的检测。
8.现有的检测维生素的电化学分析技术，主要实现方式为传统的线性扫描伏安法、常规脉冲伏安法、差分脉冲伏安法、方波伏安法、溶出伏安法等，这些方法虽然能够用来检测维生素，但灵敏度较低，特别是在同时检测血液样品中维生素a、d、e时，往往检出限较高，并且两种物质的峰分不开，达不到血液样品中维生素a、d、e的浓度水平。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种同时检测维生素a、d、e的卷积电流伏安法，克服了现有技术的不足，采用卷积电流伏安法同时测定血样中维生素a、d、e的含量，具有灵敏度高，
重现性好，峰型更加便于电流信号的测量，且操作方便快捷，检测时间较短等优点，在同一个体系能同时准确的检测血样中维生素a、d、e的含量。
10.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
11.一种同时检测维生素a、d、e的卷积电流伏安法，包括以下步骤：
12.取待测血液样品与维生素释放剂反应，使待测血液样品中结合态的维生素转变为游离态的维生素，所述维生素释放剂由溶剂和惰性支持电解质组成；利用卷积电流伏安法检测待测血液样品中维生素在经过修饰的工作电极上产生的氧化还原电流；通过比较系列不同浓度的维生素标准样品的电流信号值，与相对应的浓度制作标准曲线，根据待测样品在相同条件下产生的电流信号值，通过线性方程计算出待测血样中维生素的含量。
13.进一步，所述工作电极的修饰方法，具体包括以下步骤：
14.(1)选取玻碳电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
15.(2)在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；其中，修饰溶液由硫酸、硝酸、石墨烯、碳纳米管、硫酸钠、醋酸钠、氯化钾中的一种或几种组成。
16.进一步，所述电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法的一种。
17.进一步，所述电镀的方法为循环伏安法，且参数设置条件为初始电位
‑
0.8～
‑
0.2v，终止点位0.8～1.5v，扫描速度为20～100mv/s，循环圈数为5～15圈。
18.进一步，所述溶剂为无水乙醇，所述惰性支持电解质由醋酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、高氯酸钠中一种或几种，所述惰性支持电解质的浓度为0.0001～1mol/l。
19.进一步，检测血样中维生素a、d、e含量时，仪器参数初始电极电势为
‑
0.6～0.1v，终止电极电势为0.9～1.6v，扫描速度为25～150mv/s，工作模式为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式。
20.本发明与现有技术相比较，具有以下有益效果：
21.1、本发明通过对工作电极进行修饰，利用该修饰电极不仅可以同时检测维生素a、d、e，而且具有较高灵敏度，且三种维生素的出峰互不干扰，具有良好的重现性，能大大降低检出限。
22.2、本发明采用卷积电流伏安法能同时测定血样中维生素a、d、e的含量，具有灵敏度高，重现性好，峰型更加便于电流信号的测量，且操作方便快捷，检测时间较短等优点，在同一个体系能同时准确的检测血样中维生素a、d、e的含量。
23.3、本发明采用标准添加法同时测定样品中维生素a、d、e的含量，消除了由样品基体效应带来的干扰，降低了维生素a、d、e的检出限，测量结果准确可靠。
24.4、本发明使用对环境友好的绿色溶剂，摒弃了以往所用的dmf、二氯甲烷、乙氰溶剂等，所使用的溶剂能更好的检测维生素a、d、e的含量。
附图说明
25.图1为检测维生素a所对应的线性方程曲线。
26.图2为检测维生素d所对应的线性方程曲线。
27.图3为检测维生素e所对应的线性方程曲线。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.为进一步说明本发明的技术内容，兹列举以下实施例，并配合附图详细说明如下：
30.利用卷积电流伏安法检测血液样品中同时检测维生素a、d、e含量：取待测血液样品与维生素释放剂反应，使待测血液样品中结合态的维生素转变为游离态的维生素，所述维生素释放剂由溶剂和惰性支持电解质组成；利用卷积电流伏安法检测待测血液样品中维生素在经过修饰的工作电极上产生的氧化还原电流；通过比较系列不同浓度的维生素标准样品的电流信号值，与相对应的浓度制作标准曲线，根据待测样品在相同条件下产生的电流信号值，通过线性方程计算出待测血样中维生素的含量。
31.其中，工作电极的修饰方法，具体包括以下步骤：
32.(1)选取玻碳电极作为基体电极，对基体电极表面进行抛光清洁处理后，备用；
33.(2)在步骤(1)制备的基体电极的表面滴涂或者电镀修饰溶液，用红外灯烘干制得所述修饰电极；其中，修饰溶液由硫酸、硝酸、石墨烯、碳纳米管、硫酸钠、醋酸钠、氯化钾中的一种或几种组成，各组分的浓度范围是0.0003～0.1mol/l。
34.实施例1
35.单标准添加法同时测定血液样品中维生素a、d、e含量
36.具体实施过程：
37.1.维生素a、d、e修饰电极的预处理：选择直径2mm的市售玻璃碳电极作为维生素a、d、e传感器探头，先将电极在不同型号的金相砂纸上进行打磨，使电极表面光滑如镜面。然后再将打磨过的玻璃碳电极依次在粒径1.0μm，0.3μm以及0.05μm的氧化铝抛光粉上进行镜面抛光。最后将打磨光亮的玻璃碳电极分别置于乙醇、去离子水中各超声2分钟，以除去玻璃碳电极表面残留的有机物和吸附的氧化铝粉末，将电极用氮气吹干备用。
38.2.在表面抛光清洁处理后的玻璃碳电极表面滴涂或者电镀上修饰溶液，将电镀后玻璃碳电极用红外灯烘干后得到修饰电极；其中，电镀的方法选自循环伏安法或者电位阶跃法的一种，当电镀方法选择循环伏安法时，循环伏安法的参数设置条件为初始电位
‑
0.8～
‑
0.2v，终止点位0.8～1.5v，扫描速度为20～100mv/s，循环圈数为5～15圈。
39.2.维生素a、d、e修饰电极的制备：将处理好的修饰电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极。仪器参数设置：初始电极电势为
‑
0.8～
‑
0.2v(相对于参比电极)，终止电极电势为0.8～1.5v(相对于参比电极)，扫描速度为20～100mv/s，搅拌条件下循环扫描5～15圈，然后用去离子水清洗，氮气吹干备用。
40.3.维生素a、d、e释放剂的配制：取适量(100～1000ml)的上述单一溶剂或混合溶剂于容量瓶中，按比例称取上述单一或复合支持电解质，加入容量瓶中，盖上瓶塞，轻摇，待支持电解质溶解后，用相同溶剂添加至容量瓶刻度线，溶液中支持电解质的浓度在0.0001～1mol/l。
41.4.血液样品中维生素a、d、e的释放：用微量移液器定量移取血液样品(10～20μl)于5.0ml试管中，再定量加入0.1～2.0ml维生素a、d、e特异释放剂，盖上试管塞，轻轻摇匀，
放置5分钟，待血样中结合的维生素a、d、e释放出来，变成游离态的小分子，便可上机测定。
42.5.血液样品中维生素a、d、e的同时测定：
43.首先，将盛有待测样品溶液的试管固定在维生素检测仪的工作台上，将维生素a、d、e修饰电极作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极，一同插入待测样品溶液中检测。维生素检测仪工作模式可以选择设定为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式。测试参数为：仪器参数初始电极电势为
‑
0.6～0.1v，终止电极电势为0.9～1.6v，扫描速度为25～150mv/s，分别记录检测样品溶液中得到维生素a、维生素d和维生素e三种维生素的卷积电流记为h。
44.然后用微量移液器定量移取维生素a、d、e的标准溶液vs ml，加入样品溶液中，搅拌均匀，同样条件下检测，分别得到维生素a、维生素d和维生素e三种维生素的卷积电流记为h。
45.6.血液样品中维生素a、d、e浓度的计算：
46.血液样品中维生素a、维生素d和维生素e三种维生素的浓度都按(1)式计算：
[0047][0048]
式中c
a
为血液样品中维生素a、d、e的浓度，h是检测样品溶液维生素a、维生素d和维生素e三种维生素得到的卷积电流值，h是加入标准溶液后检测得到的卷积电流值，vx是稀释剂的体积，vs是加入的标准溶液的体积，cs是标准溶液的浓度，k是样品的稀释倍数。对于加入的维生素a、d、e标准溶液的体积和浓度应满足如下要求：
[0049]
vs<100vx，cs>100ca
[0050]
实施例2
[0051]
多标准添加法测定血液样品中维生素a、d、e含量
[0052]
具体实施过程：
[0053]
1.维生素a、d、e修饰电极的预处理：同实施例1。
[0054]
2.维生素a、d、e修饰电极的制备：同实施例1。
[0055]
3.维生素a、d、e释放剂的配制：同实施例1。
[0056]
4.血液样品中维生素a、d、e的释放：同实施例1。
[0057]
5.血液样品中维生素a、d、e的测定：
[0058]
首先，将盛有待测样品溶液的试管固定在维生素检测仪的工作台上，将修饰好的维生素a、d、e传感器作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，银/氯化银电极为参比电极，一同插入待测样品溶液中检测。维生素检测仪工作模式可以选择设定为0.5次、1.5次或2.5次微分模式，噪声滤波为低通模式。测试参数为：仪器参数初始电极电势为
‑
0.6～0.1v，终止电极电势为0.9～1.6v，扫描速度为25～150mv/s，分别记录检测样品溶液中得到维生素a、维生素d和维生素e三种维生素的卷积电流记为h0。
[0059]
然后依次用微量移液器定量移取维生素a、d、e的标准溶液v1 ml、v2ml、v3ml、
···
、vnml，分别加入样品溶液中，同样条件下依次检测，得到的卷积电流分别记为h1、h2、h3、
···
、hn，对应加入的维生素a、d、e的浓度分别为c1、c2、c3、
···
、cn(可以利用每次加入的标准溶液的体积换算得到)。附图1
‑
附图3分别为维生素a、d、e所对应的线性
方程曲线。
[0060]
6.血液样品中维生素a、d、e浓度的计算：
[0061]
分别利用卷积电流和浓度进行最小二线性拟合(未加入标准时的样品溶液的维生素a、d、e的浓度c0＝0)，得到如下线性关系：
[0062]
h＝kc+b
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0063]
因此可以得到血液样品中维生素a、d、e的浓度为
[0064]
c
a
＝
‑
b
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0065]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。